懷地黃不同種質(zhì)雜交育種初步研究

李建軍，徐玉隔，王 瑩，盧新花，李靜云，范紅軍，楊 麗

(1．河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007;2．河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心;河南新鄉(xiāng)453007;3．封丘縣農(nóng)村科技研究開(kāi)發(fā)推廣中心，河南封丘453341)

地黃是玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch)的新鮮或干燥塊根．地黃為補(bǔ)益中藥中常用藥物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［1］．地黃主要產(chǎn)于河南、河北、山東、山西等地，其中河南產(chǎn)量大、質(zhì)量佳，為傳統(tǒng)的道地藥材．以舊稱“懷慶府”的河南溫縣、武陟、沁陽(yáng)、孟州等地為地黃的道地藥材產(chǎn)區(qū)，懷慶主產(chǎn)的地黃習(xí)稱為“懷地黃”［2］．懷地黃因長(zhǎng)期的自然選擇與人工篩選，種質(zhì)表現(xiàn)出顯著的遺傳多樣性，形成了很多農(nóng)家品種．目前雜交試驗(yàn)所用主要農(nóng)家品種有85－5、北京1號(hào)、生津、北京3號(hào)、沁懷、懷地1號(hào)、懷地2號(hào)、懷地3號(hào)等［3～6］．長(zhǎng)期的無(wú)性繁殖，會(huì)出現(xiàn)根莖變細(xì)，產(chǎn)量下降，質(zhì)量變差，最終喪失品種的優(yōu)良特性．在種植過(guò)程中，為節(jié)約用種量，將細(xì)長(zhǎng)根莖留種，大的根莖作商品，無(wú)形中實(shí)現(xiàn)了選劣汰優(yōu)，導(dǎo)致種性退化［7］．本試驗(yàn)通過(guò)懷地黃農(nóng)家品種間的雜交，創(chuàng)制出新的懷地黃新種質(zhì)，并為選育雜交優(yōu)良新品種奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)地黃種質(zhì)資源的保護(hù)與可持續(xù)利用有重要的意義．

1 材料與方法

1．1 供試材料

供試材料為封丘資源圃中的8個(gè)懷地黃農(nóng)家栽培品種(2011－07種植)和1個(gè)野生地黃品種，8個(gè)農(nóng)家品種分別為85－5、北京1號(hào)、生津、北京3號(hào)、沁懷、懷地1 號(hào)、懷地2 號(hào)、懷地3 號(hào)［8～13］，見(jiàn)表1．

1．2 雜交組合

采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)進(jìn)行雜交試驗(yàn)，將各個(gè)品種分別作為母本和父本與不同品種進(jìn)行雜交和自交授粉試驗(yàn)．野生地黃僅作為雜交父本，與其他品種雜交．因此共有72個(gè)雜交組合，每個(gè)雜交組合做10朵花，重復(fù)3次．

1．3 雜交方法

1．3．1 親本的株選 8個(gè)地黃品種85－5，北京1號(hào)，生津，北3號(hào)，沁懷，懷地1號(hào)，懷地2號(hào)，懷地3號(hào)，分別編號(hào)為 1，2，3，4，5，6，7，8．選擇具有代表品種性狀的、生長(zhǎng)健壯無(wú)病蟲(chóng)害的典型植株作為雜交的親本．

1．3．2 花序選擇及整枝疏花 一般自然生長(zhǎng)的種株分枝較多，而作雜交親本時(shí)，為便于操作并保證營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，使種子發(fā)育飽滿，要適當(dāng)整理植株，去除過(guò)多無(wú)效的高次分枝，用剪刀將株上的其他花去除，只留下將要雜交的花．

1．3．3 花粉采集 雜交前在生長(zhǎng)健壯的父本植株上剪取發(fā)育良好即將開(kāi)放的花蕾，放于玻璃瓶中．

1．3．4 去雄 選開(kāi)花前1～2 d的花蕾，此時(shí)花比較長(zhǎng)還沒(méi)有開(kāi)放，處于似開(kāi)非開(kāi)的狀態(tài)．用鑷子輕輕地將花瓣撥開(kāi)，并插入花藥基部，夾住花藥向上一撥即可．注意把花藥清除干凈，撐開(kāi)操作時(shí)不要損壞柱頭，盡量減少破壞花冠，以使柱頭仍處在一個(gè)適宜的環(huán)境之中．去雄時(shí)間一般應(yīng)在6:00—8:00和16:00—18:00，因這時(shí)溫度低，花器失水少，也有利于傷口的愈合．

1．3．5 授粉套袋 在去雄后即可授粉．用毛筆沾取父本的花粉涂在母本雌蕊的柱頭上，授粉后，立即套上硫酸紙袋封好，進(jìn)行隔離，并掛上標(biāo)簽注明雜交組合和授粉日期．授粉時(shí)特別要注意，每個(gè)組合授粉完畢后，必須用酒精棉球?qū)㈣囎訌氐紫竞?，再做下一個(gè)組合．授粉的時(shí)間在8:00—10:00和16:00—18:00為佳．

1．3．6 授粉管理 雜交后的最初幾天要檢查紙袋，如脫落、破碎，有可能發(fā)生了以外的雜交，這些雜交花無(wú)效，應(yīng)重新補(bǔ)做．生長(zhǎng)期間搞好田間水肥管理，及時(shí)鋤草，確保雜交種的正常成熟．授粉7～10 d后，當(dāng)花瓣萎謝，柱頭因受精而干枯變黑色，即可去袋．去袋時(shí)可以統(tǒng)計(jì)雜交的結(jié)果數(shù)，初步統(tǒng)計(jì)結(jié)果率．

1．3．7 蒴果采收 授粉后1個(gè)月左右蒴果成熟開(kāi)裂，以組合為單位，按區(qū)號(hào)和相應(yīng)的組合名稱將雜交成熟蒴果單收單曬，妥善保存，以備播種，并統(tǒng)計(jì)獲得雜交蒴果的數(shù)量，計(jì)算每個(gè)雜交組合結(jié)果率．

1．4 結(jié)籽統(tǒng)計(jì)

地黃果實(shí)成熟開(kāi)裂后采回試驗(yàn)室．統(tǒng)計(jì)每個(gè)朔果所含發(fā)育成熟的種子個(gè)數(shù)，并用1/10 000電子天平稱量其總重，并計(jì)算出種子的千粒重．

2 結(jié)果與分析

2．1 結(jié)實(shí)統(tǒng)計(jì)分析

地黃授粉后其子房出現(xiàn)3種情況:①子房隨花瓣的凋謝而萎蔫;②花瓣凋謝而子房逐漸膨大，但不能正常發(fā)育成蒴果而中途凋謝;③花瓣凋謝而子房逐漸膨大，發(fā)育成成熟的蒴果．結(jié)果率是按第3種情況統(tǒng)計(jì)的，72個(gè)雜交組合結(jié)果率見(jiàn)表2．

表2 地黃不同種質(zhì)雜交結(jié)果率Table 2 The hybrid ftuit rate of different Rehmannia glutinosa germplasms %

由表2可知，試驗(yàn)共進(jìn)行了72個(gè)雜交組合，最終61個(gè)雜交組合獲得種子．地黃品種間雜交結(jié)實(shí)率在30% ～100%，其中，生津×懷地1號(hào)雜交結(jié)實(shí)率最低為30%;其次，北京1號(hào)×生津、北京1號(hào)×懷地2號(hào)、生津×北京1號(hào)、生津×懷地2號(hào)和沁懷×懷地2號(hào)雜交結(jié)實(shí)率為50%;其三，生津×懷地3號(hào)、北京3號(hào)×沁懷、懷地1號(hào)×懷地2號(hào)、懷地1號(hào)×懷地3號(hào)、懷地2號(hào)×生津、懷地3號(hào)×沁懷、懷地3號(hào)×懷地1號(hào)和懷地3號(hào)×懷地2號(hào)雜交組合結(jié)實(shí)率最高為100%;野生地黃作為父本與8個(gè)地黃農(nóng)家品種雜交結(jié)實(shí)率比較高，在70% ～100%之間;各個(gè)品種自交結(jié)實(shí)率為0，說(shuō)明遺傳基礎(chǔ)一致性不親和;特殊情況是85－5×懷地3號(hào)正反交結(jié)實(shí)率均為0，原因是懷地3號(hào)是從85－5中選育出來(lái)的優(yōu)勢(shì)株，遺傳基礎(chǔ)一致，可以認(rèn)為是同一品種;說(shuō)明懷地黃品種間雜交，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，雜交結(jié)實(shí)率越高，懷地黃品種內(nèi)雜交不親和，詳細(xì)機(jī)理有待進(jìn)一步研究．

2．2 結(jié)籽情況統(tǒng)計(jì)分析

成熟蒴果內(nèi)有2類種子:一類褐色種子是發(fā)育成熟的，可直接播種繁殖．另一類白色扁小種子是發(fā)育不成熟的，不能正常發(fā)育繁殖，在凈種過(guò)程中去除這類種子．本實(shí)驗(yàn)只統(tǒng)計(jì)發(fā)育成熟的種子．根據(jù)雜交組合結(jié)果數(shù)量和結(jié)籽數(shù)量，統(tǒng)計(jì)單果平均籽粒數(shù)并計(jì)算千粒重，結(jié)果見(jiàn)表3．

由表3可知，單蒴果平均結(jié)籽數(shù)因親本不同差別較大，為58～384粒，最少是沁懷×85－5為58粒，最多是北京3號(hào)×野生地黃為384粒．種子的千粒重差別也較大，為0．081 2 ～0．140 8 g，最低是北京1號(hào)×生津千粒重為0．081 2 g，說(shuō)明種子小而不飽滿，最高是懷地2號(hào)×野生地黃千粒重達(dá)0．140 8 g，說(shuō)明種子大而飽滿．在所有雜交組合中，與野生品種雜交地黃單蒴果平均結(jié)籽數(shù)和千粒重普遍偏高，說(shuō)明雜種優(yōu)勢(shì)明顯．后代生物產(chǎn)量、塊根產(chǎn)量和質(zhì)量是否明顯，有待進(jìn)一步研究．

表3 各品種正反交結(jié)籽情況統(tǒng)計(jì)Table 3 The statistics of reciprocal cross to win the seed of various varieties

續(xù)表 Continuing table

正交和反交的單蒴果結(jié)籽數(shù)大部分屬于正相關(guān)關(guān)系，正交單蒴果結(jié)籽數(shù)多，反交單蒴果結(jié)籽數(shù)也多，少數(shù)組合差別較大．如沁懷×懷地2號(hào)反交結(jié)籽較多、北京3號(hào)×懷地3號(hào)正交結(jié)籽較多、懷地2號(hào)×北京3號(hào)反交結(jié)籽較多、85－5×生津正交結(jié)籽較多、沁懷×懷地1號(hào)正交結(jié)籽較多，說(shuō)明這些正反交組合中有的做母本結(jié)籽較多，有的做父本結(jié)籽較多．正交和反交的千粒重大部分屬于正相關(guān)關(guān)系，正交千粒重高，反交千粒重也高，少部分組合差別較大．如85－5×生津、85－5×北京1號(hào)和北京1號(hào)×沁懷正交千粒重偏高;生津×懷地2號(hào)、北京1號(hào)×懷地3號(hào)和北京1號(hào)×生津反交千粒重偏高．

在所有雜交組合中，正交和反交的單果平均結(jié)籽數(shù)為113～384粒，正交和反交的平均結(jié)果率為45%～100%;正交和反交的單果平均結(jié)籽數(shù)與平均結(jié)果率大部分屬于正相關(guān)關(guān)系，單果平均結(jié)籽數(shù)越多，其平均結(jié)果率越高;少部分屬于負(fù)相關(guān)關(guān)系．如北京1號(hào)×沁懷、85－5×沁懷雜交單果平均結(jié)籽數(shù)最低，但其平均結(jié)果率分別為90%和80%;生津×懷地1號(hào)雜交平均結(jié)果率最低，其單果平均結(jié)籽數(shù)192粒．

3 結(jié)論與討論

72個(gè)雜交組合結(jié)實(shí)率的差異，說(shuō)明懷地黃品種間雜交，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，雜交結(jié)實(shí)率越高;懷地黃品種內(nèi)雜交不親和．自交不親和性［14－16］實(shí)質(zhì)上是自花授粉時(shí)受精過(guò)程受阻，不同物種受阻的時(shí)期有所不同．原因是玄參科的植物表現(xiàn)了配子體自交不親和，花粉管停止生長(zhǎng)，發(fā)生細(xì)胞程序性死亡［17］．配子體自交不親和中，雄配子本身的基因不能與雌蕊孢子體基因中的任何一個(gè)相同，如果相同，則花粉管不能生長(zhǎng)［17］．只有與雌蕊孢子體基因都不同的花粉才能完成受精過(guò)程．詳細(xì)分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究．

在雜交繁育的過(guò)程中，利用自交不親和系生產(chǎn)雜種是一種非常簡(jiǎn)便的制種方法．利用地黃自交不親和的特性，通過(guò)雜交可以鑒別新品種是否與現(xiàn)有品種相同．為保持地黃農(nóng)家品種資源只有通過(guò)無(wú)性繁殖，一旦消失很難恢復(fù)，故要加強(qiáng)地黃資源的保護(hù)和可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用．本試驗(yàn)表明，在所有雜交組合中，正交組合間、反交組合間都存在顯著差異，農(nóng)家品種間雜交親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，單果結(jié)籽數(shù)和千粒重越高;農(nóng)家品種與野生地黃雜交單蒴果平均結(jié)籽數(shù)和千粒重普遍偏高;正交與反交單果結(jié)籽數(shù)和千粒重沒(méi)有規(guī)律，有些品種適宜做母本，而有些品種適宜做父本，為有性繁殖和雜交育種選擇親本提供理論依據(jù)．后代發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、抗性、產(chǎn)量、品質(zhì)等指標(biāo)有待下一步研究．

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