家蠶性信息素腺體肌質(zhì)網(wǎng)膜Ca2+-ATP酶基因的分子鑒定

張松斗，陳麗君，安世恒，杜孟芳

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，河南鄭州450002)

肌質(zhì)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Ca2+-ATPase(Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)是普遍存在于動物肌肉組織中肌質(zhì)網(wǎng)膜上的離子轉(zhuǎn)運蛋白酶體［1］．Ca2+-ATPase又稱鈣泵，是肌質(zhì)網(wǎng)的主要成分，占膜蛋白總量的90%，它與Na+-K+泵和H+-K+泵的相似性較高，均屬于P型ATP酶的蛋白家族．P型ATP酶轉(zhuǎn)運離子是一個主動運輸?shù)倪^程，需要水解ATP來提供能量，且每轉(zhuǎn)運2個Ca2+需要消耗1分子的ATP，因為它有自動磷酸化的特征而被稱為P型ATP酶［2］．當(dāng)肌細胞受到外界刺激時，在Ca2+-ATP酶的作用下Ca2+由肌質(zhì)網(wǎng)釋放進入細胞質(zhì)中，同時它也可以通過消耗ATP來實現(xiàn)鈣離子的逆濃度轉(zhuǎn)運，將肌細胞胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子泵入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)外較高的鈣離子濃度差［3］．因此，Ca2+-ATP酶對于細胞來說是很重要的，鈣離子通常與細胞跨膜信號傳導(dǎo)密切相關(guān)，鈣離子濃度的變化會引起相應(yīng)的細胞內(nèi)信號途徑的反應(yīng)，導(dǎo)致一系列的生理生化變化．在大部分鱗翅目昆蟲中，性信息素是兩性間通訊交流的重要介質(zhì)，是由位于雌蟲第8和第9腹節(jié)之間的信息素腺體的上皮細胞合成，經(jīng)表皮釋放到體外［4］．性信息素多數(shù)為長鏈的不飽和醇、醋酸酯、醛或酮類，在性腺內(nèi)由乙酰輔酶A經(jīng)過脂肪酸合成、去飽和、碳鏈縮短和羰基碳的還原修飾等作用合成［5］．大部分鱗翅目昆蟲性信息素的合成和釋放由性信息素合成激活肽(Pheromone biosynthesis activating neuropeptide，PBAN)來調(diào)控的．PBAN是一類C末端為33或34個氨基酸殘基的多肽類酰胺化合物［6］．其作用機制被認為首先通過與性信息素腺體細胞膜上的受體(PBAN receptor，PBANR)結(jié)合，然后經(jīng)過一系列的信號傳遞，最終導(dǎo)致性信息素的合成和分泌．目前對于PBAN作用機制的研究多集中在模式生物家蠶(Bombyx mori)中［7］．在家蠶中，PBAN首先和PBANR結(jié)合，促進鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，內(nèi)流的 Ca2+與鈣調(diào)素蛋白(CaM)結(jié)合［8］，直接或間接激活Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II(BmCaMKII)，通過去磷酸化激活?；鵆oA還原酶和酯酶等過程，最終成功合成蠶蛾醇［9，10］．目前對SERCA基因的研究主要集中在人類、小鼠和其他一些動物，在昆蟲特別是家蠶中，其在PBAN信號傳導(dǎo)級聯(lián)途徑中的作用還沒有相關(guān)研究［11］．本試驗主要運用熒光定量PCR(RT-PCR)的方法，對SERCA基因在家蠶不同發(fā)育期和不同組織中的表達情況以及斷頭處理和保幼激素處理后的轉(zhuǎn)錄情況進行研究．這些結(jié)果為進一步研究SERCA基因在PBAN調(diào)控的性信息素合成與釋放信號傳導(dǎo)途徑的功能提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 供試昆蟲

家蠶品種為鎮(zhèn)珠×春蕾，卵由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)鄉(xiāng)蠶業(yè)研究所提供，在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲實驗室飼養(yǎng)幼蟲，溫度為(26±1)℃，光周期為L:D=16:8，相對濕度為75%．幼蟲化蛹后區(qū)分雌雄．

1．2 主要試劑

總RNA抽提試劑RNAiso Reagent(Invitrogen，USA)，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、2 × Power Taq PCR MasterMix、DL2000 Marker、DNA Fragment Purification Kit Ver．2，0 及熒光定量試劑盒(SYBR Primer script RT-PCR Kit)均購自TAKARA公司．其他均為國產(chǎn)或進口分析純試劑．

1．3 試驗方法

1．3．1 序列分析 核苷酸序列分析采用ChromasPro軟件，氨基酸序列分析采用高級生物信息學(xué)在線工具 http://www．expasy．org/tools/pi_tool．html，同源性比較采用NCBI中的BLAST工具，序列多重聯(lián)配采用ClustalW和Genedoc軟件，進化樹構(gòu)建選用MAGE4．0軟件．

1．3．2 引物設(shè)計 BmSERCA基因在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(SilkDB)上的Gene ID是BGIBMGA006603－TA．利用DNAClub軟件設(shè)計引物，正向引物為SERCA F1:5’-AAAGAAACGCCGAATCTGC-3’，反向引物為 SERCA R1:5’-TGATAAGGCGAATGTCAGCAG-3’．以家蠶核糖體蛋白基因49(Ribosomal protein，Rp49)作為內(nèi)參基因，正向引物為RpF1:5’-CAGGCGGTTCAAGGGTCAATAC-3’，反向引物為 RpR1:5’-TGCTGGGCTCTTTCCACGA-3’．引物由上海生工生物工程有限公司合成．

1．3．3 總RNA提取 包括家蠶雌蟲性信息素腺體不同發(fā)育時期和成蟲不同組織的提取兩部分內(nèi)容．其中雌蟲性信息素腺體分為－96，－72，－48，－24，0，24，48，72 h 共 8 個發(fā)育階段;成蟲取羽化當(dāng)天的成蟲，分別取頭、體壁、卵、中腸、飛行肌、脂肪體等不同組織．將不同發(fā)育時期的腺體和不同組織分別放入經(jīng)DEPC處理過的Eppendorf管中勻漿，參照Takara公司試劑說明書，用RNAiso Reagent法提取總RNA．用紫外分光光度計檢測其純度和濃度．根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，以家蠶不同發(fā)育時期的性信息素腺體和不同組織的總RNA為模板合成cDNA第1鏈備用．

1．3．4 實時熒光定量PCR Real-time PCR采用相對定量的計算方法，家蠶Rp49基因作標準化對照，在Mastercycler@ep realplex real-time PCR檢測系統(tǒng)上進行操作，反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，68 ℃延伸20 s，共35個循環(huán)．SYBR Green PCR信號的特異性可以使用溶解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測．基因的相對表達量用 2－ΔΔCT方法計算［12］．

1．3．5 BmSERCA基因的時空表達 利用合成的不同發(fā)育時期該基因的cDNA第1鏈作為模板，以SERCA F1和 SERCA R1為引物進行 Real-time PCR擴增，以Rp49作標準化對照．相對定量計算方法同 1．3．4．

以合成的不同組織的cDNA第1鏈為模板，利用SERCA F1和SERCA R1引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;隨后35個循環(huán)的擴增，擴增條件為94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min;最后72℃延伸10 min，然后4℃保存．利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR產(chǎn)物進行分析，經(jīng)EB染色后使用GenDoc凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相．

1．3．6 斷頭試驗 將不同發(fā)育階段(－72，－48，－24，0 h)的家蠶雌蟲斷頭，斷頭處理后 24，48，72 h分別解剖家蠶性信息素腺體．提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈后進行熒光定量分析．總RNA提取和隨后反轉(zhuǎn)錄的方法同1．3．3，以正常發(fā)育階段的雌蟲性信息素腺體作為對照．Real-time PCR 操作和計算方法同1．3．4．

1．3．7 體外保幼激素處理 將不同發(fā)育階段( －72，－48，－24，0 h)的家蠶雌蟲斷頭，斷頭處理后24 h解剖性信息素腺體，解剖的性信息素腺體放入含有1 mL Grace’s medium昆蟲培養(yǎng)液的組織培養(yǎng)板中，培養(yǎng)1 h后更換為新的Grace’s昆蟲培養(yǎng)液(含有2 μmol的保幼激素)．收集不同孵育間隔期(0，2，4 ，6 h)的性信息素腺體，提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，進行熒光定量分析．提取總 RNA和反轉(zhuǎn)錄的方法同 1．3．3，Real-time PCR 操作和計算方法同1．3．4．

1．3．8 統(tǒng)計分析 RT-PCR的試驗均重復(fù)3次，平均值±標準偏差分析結(jié)果．使用t測驗分析不同轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR試驗結(jié)果．

2 結(jié)果與分析

2．1 BmSERCA基因的序列分析

序列分析結(jié)果表明，BmSERCA基因開放閱讀框長度為2865 bp，編碼954個氨基酸．利用生物信息學(xué)在線工具(http://www．expasy．org/tools/Pi_tool．html)分析氨基酸序列，結(jié)果表明，該蛋白的分子量為104．6 kD，等電點為5．40．將 12種昆蟲的SERCA基因氨基酸序列進行多重聯(lián)配，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹．結(jié)果表明BmSERCA基因的氨基酸序列與其他昆蟲的SERCA基因的氨基酸序列具有較高的一致性(圖1)，其中與煙蚜夜蛾Heliothis virescens的一致性達到97%，與帝王斑蝶Danaus plexippus的一致性達到96%，與其他昆蟲的序列一致性也都在85%以上(圖2)．

2．2 BmSERCA基因的時空表達情況

2．2．1 家蠶不同發(fā)育時期SERCA基因的表達情況 Real-time PCR結(jié)果顯示，SERCA基因在家蠶羽化當(dāng)天的表達量最高，羽化前96 h表達量最低，從羽化前96 h到羽化0 h其表達量呈上升趨勢(圖3)．

2．2．2 家蠶不同組織中SERCA基因的表達情況

Real-time PCR結(jié)果顯示，SERCA基因在性信息素腺體、頭、體壁、脂肪體、飛行肌、卵中均有表達，但是在卵中的表達量相對較低，在中腸中不表達(圖4)．

2．3 斷頭處理對BmSERCA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

斷頭試驗結(jié)果表明，該基因在－72，－48，－24 h斷頭處理后轉(zhuǎn)錄水平仍然呈顯著增長的趨勢，但是在0 h斷頭后其轉(zhuǎn)錄水平卻顯著下降．與正常發(fā)育階段的雌蟲性信息素腺體相比，斷頭處理明顯抑制了BmSERCA基因的表達(圖5)．

2．4 體外保幼激素處理結(jié)果

保幼激素處理結(jié)果表明，保幼激素明顯抑制了BmSERCA基因在各個階段斷頭24 h后的轉(zhuǎn)錄水平，特別是－48 h和0 h斷頭后的轉(zhuǎn)錄水平(圖6)．

3 討論

離子的跨細胞膜運輸是引起生物組織中電流的主要原因［13］．LEE［14］解釋了 Ca2+-ATPase 和鈣離子通道中的鈣離子結(jié)合位點，并研究了鈣離子的主動和被動運輸過程．TOYOSHIMA等［15］對鈣離子傳輸?shù)慕Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、可能的傳輸通道以及抑制劑的作用進行了闡述．試驗證明細胞中鈣離子和鎂離子、鈉離子、鉀離子的濃度相差數(shù)萬倍的情況下，Ca2+-ATPase依然會選擇性的吸收鈣離子［16］．肌質(zhì)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子橫跨膜運輸是在鈣泵作用下通過鈣離子通道運輸鈣離子的過程，它的活性的大小可以反應(yīng)出各種細胞能量代謝和功能的強弱［17］．本研究中，肌質(zhì)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜 Ca2+-ATPase在家蠶中的時空表達情況表明，該基因在羽化前4 d表達量相對較低，羽化前隨著時間的推移其表達量一直在上升，并在羽化當(dāng)天表達量達到最高．這種表達模式與性信息素合成的關(guān)鍵基因保持一致［18，19］．家蠶的性信息素的主要成分是蠶蛾醇，其前體物質(zhì)主要以Triacylglycerols(TAGs)的形式存

圖1 BmSERCA和其他昆蟲SERCA的氨基酸序列多重聯(lián)配Fig．1 Amino acid sequence multiple alignment of BmSERCA with other insects homologs

黑色代表100%一致性;灰色代表80%一致性;白色代表小于80%一致性．BM．家蠶;DP．帝王斑蝶;HV．煙蚜夜蛾;BT．大黃蜂;AM．意大利蜜蜂;NV．麗蠅蛹集金小蜂;AP．豌豆蚜;TC．赤擬谷盜;AA．埃及伊蚊;AG．瘧蚊;CQ．庫蚊;DM．黑腹果蠅．下同．

The black represents 100%identity;The gray represents 80%identity;The white represents less than 80%identity．BM．Bombyx mori(NP_001157948．1);DP．Danaus plexippus(EHJ69709．1);HV．Heliothis virescens(AAD09820．1);BT．Bombus terrestris(XP_003399858．1);AM．Apis mellifera(XP_393851．3);NV．Nasonia vitripennis(XP_001603571);AP．Acyrthosiphon pisum(XP_001943129);TC．Tribolium castaneum(XP_966783．1);AA．Aedes aegypti(XP_316251．4);AG．Anopheles gambiae(XP_316251．4);CQ．Culex quinquefasciatus(XP_001868188．1);DM．Drosophila melanogaster(NP_726381．1)．The same as below．

圖6 保幼激素處理對BmSERCA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig．6 The effect of JH treatment on the transcription levels of BmSERCA gene

A．家蠶雌蟲羽化前72 h斷頭，斷頭24 h后JH處理0，2，4，6 h后BmSERCA基因的轉(zhuǎn)錄水平;B．家蠶雌蟲羽化前48 h斷頭，斷頭24 h后JH處理0，2，4，6 h后BmSERCA基因的轉(zhuǎn)錄水平;C．家蠶雌蟲羽化前24 h斷頭，斷頭24 h后JH處理0，2，4，6 h后BmSERCA基因的轉(zhuǎn)錄水平;D．家蠶雌蟲羽化前0 h斷頭，斷頭24 h后JH處理0，2，4，6 h后BmSERCA基因的轉(zhuǎn)錄水平．?dāng)?shù)據(jù)均代表3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標準偏差，＊＊和＊＊表示處理與對照(0 h)之間t－測驗差異顯著(*:0．01 ＜P ＜0．05 ，＊＊:P ＜0．01)．

A．The females at 72 h before-eclosion were decapitated．The transcription levels of BmSERCA gene after JH treatment(0，2，4 h and 6 h)after head detachment 24 h;B．The females at 48 h before-eclosion were decapitated．The transcription levels of BmSERCA gene after JH treatment(0 ，2 ，4 h and 6 h)after head detachment 24 h;C．The females at 24 h before-eclosion were decapitated．The transcription levels of BmSERCA gene after JH treatment(0，2，4 h and 6 h)after head detachment 24 h;D．The females at 0 h before-eclosion were decapitated．The transcription levels of BmSERCA gene after JH treatment(0，2，4 h and 6 h)after head detachment 24 h．The data represent the mean ± SE of three biological replicates，Significance of pairwise comparisons(treatment vs control)are marked with*or＊＊ (*:0．01 ＜P ＜0．05; ＊＊:P ＜0．01)as determined by the Student’s t-test．在于家蠶細胞質(zhì)脂滴中．脂滴在成蟲羽化前3 d或4 d開始出現(xiàn)，在成蟲羽化當(dāng)天快速積聚，達到最高值［20，21］．雌成蟲在羽化當(dāng)天即產(chǎn)生大量的性信息素［22］．PBAN在成蟲羽化之后，從腦－咽下神經(jīng)節(jié)合成，經(jīng)咽側(cè)體釋放到血淋巴中，然后直接作用于性信息素腺體細胞促進性信息素生物合成的許多步驟［23，24］．鈣離子在 PBAN 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)途徑中起著重要的作用，阻斷鈣離子的流入將會打斷PBAN信號向下游的傳導(dǎo)［25］．而SERCA的主要功能是Ca2+的運輸，是否PBAN激活Ca2+后由SERCA來運輸Ca2+還需進一步的研究．

SERCA基因在性信息素腺體、頭、體壁、脂肪體、飛行肌、卵中均有表達，但是在卵中的表達量相對較低，在中腸中不表達．該基因在－72，－48，－24 h斷頭處理后轉(zhuǎn)錄水平仍然呈現(xiàn)顯著增長的趨勢，但是在0 h斷頭后其轉(zhuǎn)錄水平卻顯著下降，這與該基因在正常發(fā)育階段的表達趨勢是一致的．但與正常發(fā)育階段的雌蟲性信息素腺體相比，斷頭對BmSERCA基因的表達有明顯的抑制作用．體外保幼激素處理試驗中，運用斷頭雌蛾的主要原因是排除內(nèi)保幼激素的影響．RT-PCR的結(jié)果表明，保幼激素明顯的抑制了該基因在各個階段斷頭24 h后的轉(zhuǎn)錄水平，特別是－48 h和0 h斷頭后的轉(zhuǎn)錄．在家蠶從蛹到成蟲的發(fā)育過程中，保幼激素的滴度也隨之增加，特別是交配后，保幼激素的滴度大幅增加，交配后的家蠶不再產(chǎn)生性信息素．本研究為進一步研究PBAN調(diào)控性信息素合成與釋放的整個信號傳導(dǎo)途徑提供理論依據(jù)．但是Ca2+-ATPase和鈣離子通道在PBAN調(diào)控性信息素合成與釋放信號級聯(lián)途徑中的具體作用機制還有待進一步闡釋．

［1］ PERIASAMY M，HUKE S．SERCA pump level is a critical determinant of Ca2+homeostasis and cardiac contractility［J］．Mol Cell Cardiol，2001，33(6):1053－1063．

［2］ 段清芬，黃海華，劉志敏．PMRl－鈣離子ATP酶研究進展［J］．生物技術(shù)通訊，2007，(3):501－504．

［3］ PEDERSON P L．Rransport ATPase in biological systerms and relationship to human disease:a brief overview［J］．J Bioenerg Biomemb，2002，34:327．

［4］ KITAMURA A，NAGASAWA H，KATAOKA H，et al．Amino acid sequence of pheromone biosynthesis activating neuropeptide(PBAN)of the silkworm Bombyx mori［J］．Biochemical and Biophysical Research Communications，1989，163:520－526．

［5］ TILLMAN J A，SEYBOLD S J，JURENKA R A，et al．Insect pheromones overview of biosynthesis and endocrine regulation［J］．Insect Biochemisty and Molecular Biology，1999，29:481－514．

［6］ RAFAELI A．Pheromone biosynthesis activating neuropeptide(PBAN):regulatory role and mode of action［J］．General and Comparative Endocrinology，2009，162:69－78．

［7］ MATSUMOTO S，OHNISHI A，LEE J M，et al．Unraveling the pheromone biosynthesis activating neuropeptide(PBAN)signal transduction cascade that regulates sex pheromone production in moths［J］．Vitamins ＆Hormones，2010，83:425 －445．

［8］ MATSUMOTO S，MOTO K，WANG F H．Cellular events and molecular mechanisms underlying sex pheromone production in the silkmoth，Bombyx mori［J］．RIKEN Review，2001，41:79－81．

［9］ MATSUMOTO S，HULL J J，OHNISHI A，et al．Molecular mechanisms underlying sex pheromone production in the silkmoth，Bombyx mori:characterization of the Molecular components involved in bombykol biosynthesis［J］．Journal of Insect Physiology，2007，53:752－759．

［10］ MOTO K，YOSHIGA T，MATSUMOTO S，et al．Pheromone gland-specific fatty-acyl reductase of the silkmoth，Bombyx mori［J］．Proceeding of the National Academy of Science，2003，100:9156－9161．

［11］ SEHULTZ J J，GLASCOCK B J，WITT S A，et al．Accelerated onset of heart failure in mice during pressure overload with chronically decreased SERCA2 calcium pump activity［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol．，286(3):1146－1153．

［12］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method［J］．Methods，2001，25:402－408．

［13］ OSTWALD W．Elektrische Eigenschaften halbdurchlassiger Scheidewande［J］．Z Phys Chem，1890，6:71 －82．

［14］ LEE A．Calcium pump made visible［J］．Curr Opin Struct Biol，2002，12:547 －554．

［15］ TOYOSHIMA C，MIZUTANI T．Crystal structure of the calcium pump with a bound ATP analogue［J］．Nature，2004，430:529－536．

［16］ DRAKE S K，LEE K L，F(xiàn)ALKE J J．Tuning the equilibrium ion affinity and selectivity of the EF-hand calcium binding motif:Substitutions at the gateway positions［J］．Biochemistry，1996，35:6697 －6075．

［17］ TANG Y L，ZHAO O，OIN X，et al．Paracrine action enhances the efects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction［J］．Aan Thorac Surg，2005，80(1):229－236．

［18］ DU M F，ZHANG S D，AN S H，et al．Identification of a diacylglycerol acyltransferase 2 gene involved in pheromone biosynthesis activating neuropeptide stimulated pheromone production in Bombyx mori［J］．Journal of Insect Physiology，2012，58(5):699－703．

［19］ DU M F，YIN X M，ZHANG S D，et al．Identification of lipases involved in PBAN stimulated pheromone production in bombyx mori using the DGE and RNAi approaches［J］．PLoS ONE，2012，7(2):e31045．

［20］ RAINA A K，JAFFE H，KEMPE T G，et al．Identification of a neuropeptide hormone that regulates sex pheromone production in female moths［J］．Science，1989，244:796－798．

［21］ MATSUMOTO S，F(xiàn)ONAGY A，YAMAMOTO M，et al．Chemical characterization of cytoplasmic lipid droplets in the pheromone-producing cells of the silkmoth，Bombyx mori［J］．Insect Biochemisty and Molecular Biology，2002，32:1447－1455．

［22］ HULL J J，LEE J M，MATSUMOTO S．Gqalpha-linked phospholipase Cbetal and phospholipase Cgamma are essential components of the pheromone biosynthesis activating neuropeptide(PBAN)signal transduction cascade［J］．Insect Molecular Biology，2010，19:553 －566．

［23］ TSFADIA O，AZRIELLI A，RAFAELI A，et al．Pheromone biosynthetic pathways:PBAN-regulated rate-limiting steps and differential expression of desaturase genes in moth species［J］．Insect Biochem Mol Biol，2008，38:552－567．

［24］ OHNISHI A，HULL J J，MATSUMOTO S，et al．Hormone signaling linked to silkmoth sex pheromone biosynthesis involves Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase II-mediated phosphorylation of the insect PAT family protein bombyx mori lipid storage droplet Protein-1(BmLsd1) ［J］．Journal of Biological Chemistry，2011，286:24101－24112．

［25］ HULL J J，LEE J M，KAJIGAYA R，MATSUMOTO S．Bombyx mori homologs of STIM1 and orail are essential components of the signal transduction cascade that regulates sex pheromone production［J］．Journal of Biologiacl Chemistry，2009，284:31200－31213．