螺旋藻小分子多肽泡沫分離法最佳工藝參數(shù)研究

郭 準(zhǔn)，周琳娜，李博生

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所，北京 100083）

螺旋藻[1-2]是存在于地球已逾30億a的低等水生藻類植物。它不僅可作為人類豐富的蛋白質(zhì)來(lái)源，其中某些蛋白質(zhì)和多肽還是重要的生理活性物質(zhì)，能促進(jìn)免疫系統(tǒng)功能，抗氧化，降血壓，延緩衰老，抵抗多種疾病。大多數(shù)的強(qiáng)抗氧化肽和降壓肽主要集中在分子量在5 000 D以下的小肽[3]。通常采用酶解法[4]得到多肽初提物后，為了進(jìn)一步得到分子量5 000 D以下的多肽，通常需要對(duì)酶解液進(jìn)行后續(xù)復(fù)雜的分離純化。采用何種分離純化方法主要取決于所提取組分物質(zhì)和目的。目前主要有毛細(xì)管電泳法、反向高壓液相色譜法、超濾法和凝膠過(guò)濾層析法等[5]，試驗(yàn)過(guò)程十分繁瑣、復(fù)雜。泡沫分離是膜分離技術(shù)的一種，它是以泡沫作為分離介質(zhì)，以組分之間的表面活性差異作為分離依據(jù)，利用在溶液中的鼓泡來(lái)達(dá)到富集物質(zhì)目的的一種新型分離技術(shù)[6]。該方法設(shè)備簡(jiǎn)單，試驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)潔，但目前采用泡沫分離法直接提取螺旋藻小分子多肽尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者以螺旋藻為原料，采用泡沫分離法直接提取螺旋藻懸浮液上清液，并對(duì)提取液進(jìn)行紫外可見(jiàn)光掃描和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜掃描，對(duì)泡沫分離提取液的主要成分進(jìn)行了確定，研究了不同pH值和料液比對(duì)螺旋藻多肽溶解率、回收率以及提取率的影響以及最佳工藝參數(shù)。最后進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，對(duì)其總還原力以及對(duì)羥基自由基和超氧陰離子的清除能力進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 螺旋藻粉，北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所提供。

1.1.2 儀器與試劑 儀器：FA1004電子天平（上海衡平儀器儀表廠）、HJ-3磁力攪拌機(jī)（金壇市金城金華儀器廠）、JKY/SJ-4A電子PH計(jì)（北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司）、TU-1901紫外分光光度計(jì)（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）、Thermo BIOFUGE PRTMO R centrifuge（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、Thermo Heto Power Dry LL1500 Freeze Dryer（美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）、4700 Proteomics Analyzer型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)（ABI）公司）；試劑：所有試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)裝置 圖1為泡沫分離的試驗(yàn)裝置示意圖。泡沫分離柱的內(nèi)徑47 mm、高度700 mm。空氣經(jīng)壓縮機(jī)壓縮后，通過(guò)氣體分布器，分散成氣泡由柱底通入螺旋藻藻懸液。泡沫沿柱體上升，到達(dá)柱頂后經(jīng)過(guò)泡沫溢出管進(jìn)入泡沫收集裝置，每次試驗(yàn)時(shí)間持續(xù)到產(chǎn)生的泡沫不能從裝置中溢出，停止通氣，每次收集的泡沫提取液采用攪拌方式消除泡沫。

圖1 試驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)

1.2.2 螺旋藻泡沫提取物的制備 準(zhǔn)確稱取0.5 g的螺旋藻粉于燒杯中，加入500 mL蒸餾水配置成料液比為1 g/L的螺旋藻藻懸液，調(diào)節(jié)pH值為9時(shí)，800 r/min磁力攪拌10 min。螺旋藻細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)充分溶解后，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入圖1所示裝置進(jìn)行泡沫提取并對(duì)提取液進(jìn)行收集。將泡沫提取液冷凍干燥后得到粗提物。

1.2.3 紫外-可見(jiàn)光掃描 將粗提物加蒸餾水配置成1 mg/mL的溶液，利用TU-1901紫外分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光掃描，初步分析提取液中所含物質(zhì)。掃描波段為200～850 nm。

1.2.4 基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜掃描將粗提物加蒸餾水配置成1 mg/mL的溶液，然后對(duì)其進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS/MS）進(jìn)行質(zhì)譜掃描，確定提取液中所含物質(zhì)及其分子量。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 分別考察不同料液比值（g/L）0.5、1、1.5、2，不同 pH 值 5、6、7、8、9，對(duì)泡沫分離法提取多肽的溶解率、回收率以及提取率的影響，確定最佳工藝參數(shù)。

1.2.6 多肽濃度的測(cè)定 采用福林酚試劑法，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)量上清液、消融后的泡沫提取液的多肽濃度[7]。

螺旋藻多肽溶解率P=（Ci×Vi）/m×100%；回收率W=（Cf×Vf）/（Ci×Vi）×100%；提取率Y=（P×W）×100%。

其中，Ci和Cf分別指上清液和提取液中多肽濃度（mg/mL），Vi和Vf分別指進(jìn)樣原液和提取液的體積（mL），m 指藻粉的質(zhì)量（mg）。

1.2.7 抗氧化活性試驗(yàn) （1）螺旋藻泡沫提取物總還原力的測(cè)定[8]：在2 mL樣品（空白用蒸餾水）中加入1%的鐵氰化鉀溶液2 mL以及濃度為0.2 mol/L的pH 6.6的磷酸鹽酸緩沖液2 mL，混合均勻后在50℃保溫20 min，然后加入10%的三氯乙酸2 mL，混合后3 000 r/min離心10 min。取上清液4 mL加入4 mL蒸餾水和0.1%的氯化鐵0.8 mL，混合均勻后在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，記A700。以Vc作為對(duì)照。濃度設(shè)計(jì) 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、10 mg/mL。吸光度A值越大，樣品還原能力越強(qiáng)。（2）螺旋藻泡沫提取物對(duì)超氧陰離子（O2）自由基清除能力的測(cè)定：采用鄰苯三酚自氧化法[9]，鄰苯三酚在弱堿條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)產(chǎn)生O2-，O2-清除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在波長(zhǎng)325 nm處吸收峰受到抑制。每支試管加入濃度為0.05 mol/L的Tris-HCL緩沖液4.5 mL（pH=8.2）、不同濃度樣品液1 mL、蒸餾水2.4 mL，搖勻后在25℃水浴保溫10 min。加入0.1 mL鄰苯三酚，搖勻，計(jì)時(shí)30 min，迅速加入0.1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，測(cè)325 nm處吸光度值 A325。以 Vc作為對(duì)照。濃度設(shè)計(jì) 0.5、1.0、2、0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL。

清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100

式中：A0為不加樣品溶液的吸光值；Ai為加入樣品溶液后的吸光值；Aj為不加鄰苯三酚的吸光值。

（3）螺旋藻泡沫提取物對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定[10]：在10 mL試管中依次加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液2.0 mL，不同濃度的樣品液2.0 mL，6 mmol/L雙氧水溶液2.0 mL，搖勻后靜置10 min，在加入6 mmol/L的水楊酸溶液2.0 mL，搖勻后靜置30 min后于510 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)510。以Vc作為對(duì)照，濃度設(shè)計(jì) 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL。

清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100

式中：A0為不加樣品溶液的吸光值；Ai為加入樣品溶液后的吸光值；Aj為不加水楊酸溶液的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡沫提取液的紫外可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描

將螺旋藻粗提取液凍干成粉末，并配置成1 mg/mL溶液后進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果顯示：提取液在220 nm附近，有明顯的吸收峰（4.162 Abs），其峰高明顯大于提取液中其他物質(zhì)。小分子在小肽的分子結(jié)構(gòu)中200～220 nm處的吸收峰主要是由肽鍵產(chǎn)生的，270～290 nm范圍內(nèi)的吸收峰（0.874 Abs）主要是由芳香氨基酸側(cè)鏈的大π鍵產(chǎn)生的[11]。由此推斷溶液中可能含有大量多肽物質(zhì)。另外，在674 nm和620 nm附近也有一定的吸收峰（0.271 Abs，0.298 Abs），推測(cè)可能為別藻藍(lán)蛋白和藻藍(lán)蛋白[12]。

2.2 泡沫提取物基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜掃描

根據(jù)紫外-可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描，初步分析可知，螺旋藻粉泡沫提取液中多肽的含量比較高。為進(jìn)一步確定提取液中所含物質(zhì)和分子量，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析方法采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜掃描（MALDI-TOF-MS），結(jié)果如圖2所示，提取液中多肽分子量大多集中在5 000 D以下。另外，分子量在10 000 D和11 000 D左右有吸收波長(zhǎng)，對(duì)比紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，為藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白。對(duì)質(zhì)譜掃描圖中2000～5000區(qū)域進(jìn)行分析可知，取液中多肽的分子量主要為：2 230、2 278、2 358、2 484、2 556、2 612、2 845、2 953、2 994、3 017、3 034、3 301、3 541、3 748、3 775、3 884、4 261 D。分子量小于5 000 D的多肽大多具有抗氧化活性能力。

圖2 提取液的基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜掃描圖

2.3 料液比和pH值對(duì)螺旋藻多肽溶解率的影響

溶解率是指原液中多肽的質(zhì)量與藻粉質(zhì)量之比。由圖3可知，隨著料液比的增加，pH值的降低，螺旋藻多肽溶解率逐漸降低。當(dāng)料液比為0.5 g/L時(shí)，pH值從5到9，多肽溶解率增加了2倍多。隨著料液比的增加，螺旋藻多肽的溶解率差距逐漸縮小，當(dāng)料液比達(dá)到2 g/L時(shí)，不同pH值下溶解率非常接近。隨著料液比的增加，pH值對(duì)溶解率的影響越來(lái)越小。另外，越接近多肽的等電點(diǎn)，多肽的溶解率越低，pH=5更接近螺旋藻多肽的等電點(diǎn)[13]。

圖3 料液比和pH值對(duì)螺旋藻多肽溶解率的影響

2.4 料液比和pH值對(duì)螺旋藻多肽回收率的影響

回收率指提取液與原液中多肽質(zhì)量的百分比。由圖4可知，在相同pH值下，隨著料液比的增加，螺旋藻多肽回收率增加。當(dāng)pH=9時(shí)，料液比從0.5 g/L增加到2 g/L，回收率從25%上升到92%，料液比對(duì)回收率影響顯著。當(dāng)料液比大于1 g/L時(shí)，多肽回收率增加的速度減緩。隨著料液比的增加，pH值對(duì)回收率的影響越發(fā)顯著，在料液比0.5 g/L時(shí)，W（pH=9）與W（pH=7）相差4%，在料液比2 g/L時(shí)，W（pH=9）與W（pH=7）的差值增加至近30%。

2.5 料液比和pH值對(duì)螺旋藻多肽提取率的影響

圖4 料液比和pH值對(duì)螺旋藻多肽回收率的影響

提取率是指提取液螺旋藻多肽質(zhì)量與藻粉質(zhì)量的百分比。提取率的值等于回收率和溶解率的乘積。由圖5可知，在相同料液比下，提取率隨pH值的增加而提高；相同pH值下，提取率隨著料液比的增加先提高而后降低。在pH=9時(shí)，當(dāng)料液比從0.5 g/L增加到1 g/L后，提取率提高了近2倍。在所選pH值和料液比范圍內(nèi)，當(dāng)pH=9、料液比為1g/L時(shí)，螺旋藻多肽提取率達(dá)到最大值。綜合考慮溶解率、回收率和提取率3種因素，選取pH=9、料液比1 g/L為最佳工藝參數(shù)。

圖5 料液比和pH值對(duì)螺旋藻多肽提取率的影響

2.6 螺旋藻多肽的總還原力

由圖6可知，螺旋藻多肽提取物在濃度較低范圍內(nèi)，同Vc相比，還原能力較差。在測(cè)定范圍內(nèi)隨著濃度的增加吸光度值也增加，說(shuō)明多肽提取物的還原能力具有較好的效量關(guān)系。Vc是較強(qiáng)還原劑，低濃度時(shí)還原能力已經(jīng)很強(qiáng)，隨著濃度增加吸光度值增加緩慢。在濃度為10 mg/mL時(shí)，多肽提取物的還原能力達(dá)到同濃度Vc的81.7%。

圖6 螺旋藻多肽、Vc的還原能力

2.7 螺旋藻多肽對(duì)超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是所有氧自由基中的第一個(gè)自由基，可經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成其他氧自由基，氧化能力很強(qiáng)，因此清除超氧陰離子具有特別重要的意義。由圖7可知，多肽提取物對(duì)鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的超氧陰離子有一定清除作用，隨著濃度增加多肽提取物對(duì)超氧陰離子的清除率上升，劑量關(guān)系明顯。當(dāng)多肽提取物濃度為6 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率達(dá)到47.3%。而對(duì)于Vc來(lái)說(shuō)，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，對(duì)超氧陰離子的清除率迅速增大達(dá)到100%，然后保持不變。

圖7 螺旋藻多肽、Vc對(duì)超氧陰離子的清除作用

2.8 螺旋藻多肽對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定

羥基自由基是生命活動(dòng)代謝過(guò)程所產(chǎn)生的自由基中最強(qiáng)的氧化劑，比高錳酸鉀和重鉻酸鉀的氧化性還強(qiáng)，是氧氣的三電子還原產(chǎn)物，反應(yīng)性極強(qiáng)，只要一產(chǎn)生，就會(huì)和緩沖液發(fā)生反應(yīng)，幾乎可以和所有細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，對(duì)機(jī)體傷害極大。由圖8可知，隨著濃度增加，多肽提取物和Vc對(duì)羥自由基的清除率同時(shí)增大，多肽提取物的增率較Vc小一些。Vc在2 mg/mL時(shí)，清除率已達(dá)到100%，隨后保持不變。多肽提取物在較小濃度5 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為87.93%。由此可見(jiàn)，多肽提取物對(duì)羥自由基的清除效果較好。

圖8 螺旋藻多肽、Vc對(duì)羥基自由基的清除作用

3 討論與結(jié)論

采用泡沫分離法提取螺旋藻多肽，對(duì)提取液進(jìn)行紫外可見(jiàn)光掃描和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜掃描發(fā)現(xiàn)，多肽分子量主要集中在5 000 D以下。綜合考慮溶解率、回收率和提取率3種因素，選取pH=9、料液比1 g/L為最佳工藝參數(shù)。對(duì)提取物進(jìn)行抗氧化研究發(fā)現(xiàn)，提取物有一定抗氧化能力且與濃度呈劑量關(guān)系。提取物的還原能力和超氧陰離子清除能力與Vc相比較低，可能因?yàn)槠涑煞謴?fù)雜且未純化有關(guān)。但其對(duì)羥自由基的清除能力，在較低濃度5 mg/mL時(shí)，達(dá)到了相同濃度Vc的87.93%，具有較好的清除率。

泡沫分離法與常用的酶解法提取多肽相比，前者得到的多肽分子量大多在5 000 D以下，且具有較強(qiáng)的抗氧化能力。后者為了得到分子量5 000 D以下的抗氧化多肽需要對(duì)其進(jìn)行更加復(fù)雜的分離純化，選用超濾過(guò)膜或凝膠層析[14-15]。兩者提取率相差不大[16]，泡沫分離法實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，方法簡(jiǎn)潔、環(huán)保，通常只需30～40 min，耗時(shí)較短。而酶解法通常需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，種類繁多的化學(xué)試劑，繁瑣的蛋白提取步驟，耗時(shí)較長(zhǎng)[17]。對(duì)于泡沫分離法提取的小分子多肽，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是一種天然的抗氧化劑，可應(yīng)用在保健品和食品與飼料添加劑等方面。另外，抗氧化活性通常還與抑菌活性相關(guān)[18]，還可以對(duì)其進(jìn)行更廣泛的研究。

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