葡萄MAPK基因家族鑒定及逆境脅迫下的表達(dá)分析

馬宗桓,黃青勇,李艷梅,李文芳,毛 娟,陳佰鴻

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,蘭州 730070)

植物促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中極為重要的一類蛋白激酶,含有11個(gè)高度保守的亞結(jié)構(gòu)域[1]。MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者,所有的真核細(xì)胞都能表達(dá)MAPK,能被不同的細(xì)胞外刺激,如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附[2]。MAPK信號(hào)通路一般包括功能相互關(guān)聯(lián)的3個(gè)蛋白激酶:促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPK/MAP3K/MEKK)、促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPK/MAP2K/MAKK)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK/MPK)。研究表明MAPKKKs、MAPKKs和MAPKs都是多基因家族。例如,擬南芥基因組中含有20個(gè)MAPK,10個(gè)MAPKK,80個(gè)MAPK K K基因[3-4]。MAPKKK通常作用于MKK的S/T-xxxxx-S/T(S、T和x分別表示絲氨酸、蘇氨酸和任意氨基酸)位點(diǎn)將其磷酸化并激活,隨后,活化的MKK磷酸化MAPK的蘇氨酸和酪氨酸殘基(TXY)從而激活MAPK,MAPK能將細(xì)胞膜表面受體感知到的信號(hào)通過磷酸化和去磷酸化作用進(jìn)行逐級(jí)放大并傳遞到細(xì)胞內(nèi),靶向激活胞質(zhì)或核內(nèi)的其他激酶、酶或轉(zhuǎn)錄因子等效應(yīng)蛋白,調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá),從而促使細(xì)胞、組織、器官、整個(gè)生物體作出相應(yīng)的生理生化反應(yīng),進(jìn)而適應(yīng)環(huán)境和抵御逆境脅迫[2-4]。

MAPK信號(hào)途徑在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[5],例如擬南芥中,At-MPK1和At MPK4參與調(diào)節(jié)系統(tǒng)抗性[6-7],煙草中,MAPK基因能被各種生物脅迫和防御激素所激 活[8]。水 稻 中,OsBWMK1、Os MAPK3、Os-MAPK5和Os MPK8被證實(shí)與抗病性、激素信號(hào)及非生物脅迫相關(guān)[9-10]。紫花苜蓿中,MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)能被真菌誘導(dǎo)子激活,也參與非生物脅迫響應(yīng)[11]。

本研究擬對(duì)葡萄MAPK基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)及不同非生物脅迫下的表達(dá)水平分析,以期為葡萄抗逆基因的篩選提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料為保存在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹生理與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的‘黑比諾’葡萄(Vitis viniferaPinot noir)試管苗,2021年3月將保存試管苗的單芽莖段接種于GS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基添加0.2 mg·L-1IAA,p H 5.8～6.0,溫度25℃/20℃(光照/黑暗),光周期16 h/8 h(光照/黑暗)。采用紙橋法進(jìn)行固定,培養(yǎng)30 d后,試管苗高度達(dá)到12 cm左右,挑選生長(zhǎng)狀況一致且無污染的葡萄試管苗作為試驗(yàn)材料進(jìn)行處理。處理方式為小心倒出原培養(yǎng)基,再重新分別加入50 m L含10% PEG、500μmol·L-1ABA和200 mmol·L-1NaCl的GS液體培養(yǎng)基,每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù),對(duì)照加入等體積液體培養(yǎng)基,處理24 h后提取試管苗總RNA。

1.2 葡萄MAPK基因家族序列數(shù)據(jù)獲取

從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中下載擬南芥MAPK基因的氨基酸序列;從水稻基因組網(wǎng)站RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)

下載水稻的氨基酸序列。將已獲得的擬南芥和水稻的氨基酸序列作為誘餌序列在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/)中進(jìn)行Blat-Search,搜索得到葡萄MAPK基因,然后通過SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)和Pfam網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)確認(rèn)是否含有MAPK保守結(jié)構(gòu)域,去除結(jié)構(gòu)域缺失或不完整的序列,從而確定最終的候選基因。下載基因的全長(zhǎng),CDS序列,氨基酸序列。

1.3 葡萄MAPK家族成員生物信息學(xué)分析

利用Ex PASy數(shù)據(jù)庫(kù)(https://web.expasy.org/protparam/)中的ProtParam工具進(jìn)行蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)、氨基酸大小、分子量等基本信息的分析;利用Maplnspect軟件進(jìn)行基因染色體上的位置分析。利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行葡萄MAPK家族成員的進(jìn)化分析;運(yùn)用Predict Protein(http://www.predictprotein.org/signin#)

在線分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)域;在線軟件GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析;使用DNAMAN進(jìn)行結(jié)構(gòu)域序列多重比對(duì)。

1.4 葡萄MAPK家族基因芯片表達(dá)模式分析

利用PLExdb軟件(http://www.plexdb.org/index.php)進(jìn)行MAPK家族RNA-Seq數(shù)據(jù)獲得,以核酸為探針探索出相似度最高Affytmetrix Gene Chip 16K基因ID,然后利用檢索到的ID(例如:1622318-at)在Excel中分別提取各成員在鹽、PEG、冷害以及ABA脅迫下的RNA-Seq數(shù)據(jù),再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)n函數(shù)轉(zhuǎn)換。最后使用Heml1.0.3.7軟件進(jìn)行熱圖制作。組織特異性表達(dá)數(shù)據(jù)來自平臺(tái)(GPL13936 NimbleGen 090918 Vitus vinifera exp HX12[090918_Vitus_exp])(登錄號(hào):GSE36128),選取的數(shù)據(jù)來自葡萄不同時(shí)期的器官,利用TBtools繪制熱圖。

1.5 葡萄MAPK家族成員q RT-PCR分析

將葡萄MAPK基因家族的CDS序列提交到生工生物工程(上海)股份有限公司網(wǎng)站進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)。以提取的總RNA為模板,用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)試劑盒進(jìn)行cDNA第1鏈的合 成,將0.5～2μg純化 的總RNA反轉(zhuǎn)錄成第1鏈c DNA,作為基因擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)的模板。其中,試驗(yàn)中應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler96 Real-Time PCR System,Roche,瑞士),使用SYBR GreenⅠ(Ta KaRa)試劑盒。以葡萄GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,擴(kuò)增體系含2μL cDNA,0.8μL上、下游引物(表1),10μL反應(yīng)MIX,6.4μL dd H2O,總體積20μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃下變性30 s,95℃變性5 s,60℃下 退 火30 s,40個(gè) 循 環(huán);95℃15 s,60℃30 s,95℃15 s。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt計(jì)算。

表1 葡萄MAPK家族表達(dá)分析的實(shí)時(shí)熒光定量引物Table 1 qRT-PCR primers for expression analysis of MAPK in grape

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Origin 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖,用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用最小顯著差異法(LSD)比較不同數(shù)據(jù)組間的差異,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),顯著性水平設(shè)定為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄MAPK家族基因理化性質(zhì)分析

利用擬南芥和水稻MAPK氨基酸序列在葡萄基因組網(wǎng)站中Blat搜索到43個(gè)葡萄MAPK基因,分別命名為Vv MAPK1～Vv MAPK43。葡萄MAPK家族氨基酸大小為114～1 520 aa,Vv MAPK20氨基酸序列最長(zhǎng),有1 520個(gè)氨基酸殘基。Vv MAPK23氨基酸序列最短,只有114個(gè)氨基酸殘基。分子質(zhì)量為12.26～169.94 ku。等電 點(diǎn) 集 中 在4.94～10.01之 間,其 中Vv MAPK17的等電點(diǎn)最低,Vv MAPK23等電點(diǎn)最高(表2)。葡萄MAPK家族成員不均勻的分布在葡萄的15條染色體上,其中第5號(hào)染色體和第18號(hào)染色體分布的基因最多,第1、7、8、11號(hào)染色體上僅有1個(gè)基因(圖1)。

表2 葡萄MAPK家族理化性質(zhì)分析Table 2 Information and physicochemical properties of grape MAPK gene family

圖1 葡萄MAPK家族染色體定位Fig.1 Chromosome mapping of grape MAPK gene family

2.2 葡萄Vv MAPK家族基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析

葡萄MAPK基因結(jié)構(gòu)分析表明,43個(gè)Vv MAPK基因內(nèi)含子和外顯子含量差異較大,整個(gè)基因家族的外顯子數(shù)在1到17個(gè)不等。其中10個(gè)基因不含有上游和下游基因序列,分別是Vv MAPK5、Vv MAPK8、Vv MAPK15、Vv MAPK28、Vv MAPK30、Vv MAPK37、Vv MAPK38、Vv MAPK39、Vv MAPK40和Vv MAPK43。7個(gè)基因僅含有一個(gè)外顯子,分別是Vv MAPK3、Vv MAPK14、Vv MAPK21、Vv MAPK23、Vv MAPK24、Vv MAPK25和Vv MAPK36(圖2)。利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果如圖3所示,葡萄MAPK家族可分為2個(gè)亞族,第Ⅰ亞族共有10個(gè)成員,第Ⅱ亞族有33個(gè)成員。其中Vv MAPK1和Vv MAPK33、Vv MAPK24和Vv MAPK25、Vv MAPK30和Vv MAP32的親緣關(guān)系較為緊密。Vv MAPK29和Vv MAPK22、Vv MAPK34和Vv MAPK10親緣關(guān)系較近。

圖2 葡萄MAPK家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Gene structure analysis of grape MAPK family

圖3 葡萄MAPK家族成員進(jìn)化分析Fig.3 Evolution analysis of grape MAPK gene family

2.3 葡萄MAPK家族成員基因芯片數(shù)據(jù)分析

基因芯片表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),經(jīng)ABA處理后,Vv MAPK5、Vv MAPK7和Vv AMAPK13基 因的表達(dá)量明顯下調(diào)表達(dá),而其他基因表達(dá)量不太明 顯。當(dāng) 在 鹽、PEG、低 溫 處 理 條 件 下,Vv MAPK6、Vv MAPK9和Vv MAPK13的 表 達(dá)量明顯上調(diào);Vv MAPK1的表達(dá)量明顯下調(diào)。此外,不同時(shí)間的逆境脅迫對(duì)葡萄MAPK基因家族的表達(dá)存在不同的影響。如Vv MAPK5、Vv MAPK6和Vv MAPK7在鹽和PEG處理24 h之后的表達(dá)量明顯高于CK1(圖4)。

圖4 非生物脅迫下葡萄MAPK基因表達(dá)譜Fig.4 Expression profile of MAPK gene in Vitis vinifera

從葡萄eFP瀏覽器數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到43個(gè)葡萄MAPK基因,用TBtools將這些基因在不同組織的不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)進(jìn)行可視化作圖(圖5)。總體來看,Vv MAPK在不同組織以及不同組織的不同生長(zhǎng)階段存在顯著的表達(dá)差異,其中Vv MAPK17、Vv MAPK14、Vv MAPK15和Vv MAPK28在結(jié)果時(shí)期的葉片中表達(dá)量最高,預(yù)示這些基因可能在葡萄果實(shí)發(fā)育中起到重要作用。Vv MAPK 15、Vv MAPK 23、Vv MAPK 24、Vv MAPK25和Vv MAPK36在衰老的葉片中表達(dá) 量 較 高,Vv MAPK22、Vv MAPK19、Vv MAPK9和Vv MAPK37的表達(dá)量隨著種子的發(fā)育顯著增高,表明這些基因在葡萄種子發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要作用。此外,在葡萄莖的發(fā)育過程中,Vv MAPK4、Vv MAPK16、Vv MAPK18、Vv MAPK20的表達(dá)顯著升高。大多數(shù)基因在發(fā)育過程中不同組織的表達(dá)水平相對(duì)較低。

圖5 葡萄MAPK基因組織特異表達(dá)譜Fig.5 Tissue specific expression profile of MAPK gene in grape

2.4 葡萄MAPK基因順勢(shì)作用元件分析

為了分析葡萄Vv MAPK基因家族可能參與的生物學(xué)調(diào)控,對(duì)該基因家族的起始密碼子上游2 kb序列進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)Vv MAPK基因的啟動(dòng)子中均含有不同類型的順式作用元件,分別有響應(yīng)激素信號(hào)、干旱、低溫、光照的順式作用元件,并且43個(gè)基因所分布的作用元件較為均勻。其中響應(yīng)光信號(hào)的作用元件在所有基因中分布相對(duì)均勻。有5種激素相關(guān)的順式作用元件在Vv MAPK基因家族的啟動(dòng)子中鑒定出來,其中Vv MAPK18、Vv MAPK19和Vv MAPK20中響應(yīng)ABA的作用元件分布較為集中,響應(yīng)IAA的元件多集中分布在上游1 500～2 000 bp的基因序列中(圖6)。

圖6 葡萄MAPK基因順勢(shì)作用元件Fig.6 Expression profile of MAPK gene in Vitis vinifera

2.5 葡萄MAPK基因的實(shí)時(shí)熒光定量分析

VvMAPK基因家族各成員受200 mmol·L-1NaCl、500μmol·L-1ABA和10% PEG的 誘導(dǎo),各處理間表達(dá)量具有明顯的差異,Vv MAPK9、Vv MAPK27和Vv MAPK29、VvMAPK38和VvMAPK42分別在200 mmol·L-1NaCl、500μmol·L-1ABA和10%PEG處理后表達(dá)水平均顯著上調(diào),Vv MAPK42在10%PEG處理后表達(dá)水平上調(diào)最為顯著,為CK的5.5倍,其他幾個(gè)成員在200 mmol·L-1NaCl處理后表達(dá)水平上調(diào)顯著,Vv MAPK27和Vv MAPK38分別為CK的3 500倍和140倍。Vv MAPK5、Vv MAPK12、Vv MAPK13、Vv MAPK23、Vv MAPK24、Vv MAPK26、Vv MAPK28、Vv MAPK35、Vv MAPK39和Vv MAPK41對(duì)200 mmol·L-1NaCl脅迫反映強(qiáng)烈,與對(duì)照相比,顯著上調(diào)表達(dá),Vv MAPK7在10% PEG處理后上調(diào)表達(dá)顯著。Vv MAPK9、Vv MAPK12、Vv MAPK27、Vv MAPK29、Vv MAPK38、Vv MAPK39和Vv MAPK42在500μmol·L-1ABA處理后相比對(duì)照上調(diào)表達(dá)顯著,而Vv MAPK5、Vv MAPK7和Vv MAPK23表達(dá)水平顯著下調(diào)。Vv MAPK13、Vv MAPK24、Vv MAPK26、Vv MAPK35和Vv MAPK41在500μmol·L-1ABA和10%PEG處理后表達(dá)均顯著下調(diào)(圖7)。

圖7 葡萄MAPK基因家族熒光定量表達(dá)分析Fig.7 Fluorescence quantitative expression analysis of MAPK gene family in Vitis vinifera

3 討論與結(jié)論

MAPK基因還有一個(gè)MAPK級(jí)聯(lián)途徑,包括MAPKKK(MAP3K或MEKK)、MAPKK(MAP2K或MKK或MEK)、MAPK(MPK)3組成員,是真核生物中廣泛存在且高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,參與植物細(xì)胞分化與發(fā)育[12-13]、成熟、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫等過程[14-15]。同時(shí),響應(yīng)多種生物與非生物脅迫[16-17]。本研究通過已知擬南芥和水稻MAPK蛋白序列從葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中同源搜索到43個(gè)Vv MAPK基因,而基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化樹分析顯示這些成員可以歸到2個(gè)亞族。不同成員在細(xì)胞內(nèi)的定位都不一樣,主要有葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜上。亞細(xì)胞定位可反映出成員潛在的功能,比如定位于線粒體中的MAPK主要用于清除脂肪酸β氧化物產(chǎn)生的過氧化氫,而定位于葉綠體中的MAPK主要用于保護(hù)光和活性氧免受活性氧的危害[18]。葡萄MAPK蛋白主要在葉綠體、線粒體和細(xì)胞核中進(jìn)行表達(dá),因此說明這個(gè)MAPK基因家族主要集中在光合作用,呼吸作用代謝比較強(qiáng)的器官當(dāng)中。

植物MAPK基因在不同的器官和組織中呈現(xiàn)出特定的時(shí)空表達(dá)特性,Zhang等[19]從葡萄葉片分離到一個(gè)受高溫脅迫的MAPK(Vv MPK6)基因,并在根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中均有表達(dá)。辣椒Ca MPK9在葉中的表達(dá)水平高于其他器官[1];棉花中Gb MPK3在根、花瓣、花藥和纖維中呈現(xiàn)高表達(dá),而在葉片中則幾乎檢測(cè)不到[20]。燕山葡萄中Vy MAPK2主要在根中表達(dá),Vy-MAPK3主 要 在 葉 中 表 達(dá)[18]。本 研 究 中Vv MAPK17、Vv MAPK14、Vv MAPK15和Vv MAPK28在結(jié)果時(shí)期的葉片中表達(dá)量最高,Vv MAPK15、Vv MAPK23、Vv MAPK24、Vv MAPK25和Vv MAPK36在衰老的葉片中表達(dá) 量 較 高,Vv MAPK22、Vv MAPK19、Vv MAPK9和Vv MAPK37的表達(dá)量隨著種子的發(fā)育顯著增高,暗示不同成員在器官發(fā)育中參與了相關(guān)的生理活動(dòng)。

植物體本身具有一些特異性方面相關(guān)的調(diào)控機(jī)制,通過信號(hào)方式,調(diào)控一系列相關(guān)抗性基因的表達(dá),從而可以提高植物在抵御逆境脅迫中的能力[21]。研究表明,Vv MPK6基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到極端環(huán)境溫度、干旱、鹽害以及滲透脅迫等非生物脅迫的相關(guān)調(diào)控[19]。擬南芥中,NaCl處理能在短時(shí)間內(nèi)激活A(yù)t MPK6基因,增強(qiáng)植物的抗鹽性[22]。Singh等[23]發(fā)現(xiàn)外源生長(zhǎng)素及細(xì)胞分裂素處理可以誘導(dǎo)水稻Os MAPKK3/6和Os MAPK3/6基因的表達(dá)。本研究對(duì)葡萄試管苗進(jìn)行非生物脅迫處理,研究了MAPK家族成員的響應(yīng)情況。對(duì)隨機(jī)選取的19個(gè)葡萄MAPK基因家族成員進(jìn)行非生物脅迫表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)成員均對(duì)NaCl脅迫反應(yīng)敏感,Vv MAPK5、Vv MAPK12、Vv MAPK13、Vv MAPK23、Vv MAPK24、Vv MAPK26、Vv MAPK28、Vv MAPK35、Vv MAPK39和Vv MAPK41對(duì)200 mmol·L-1NaCl脅迫反映強(qiáng)烈,與對(duì)照相比,上調(diào)表達(dá)顯著,Vv MAPK27和Vv MAPK38分別為CK的3 500倍和140倍,說明該基因家族成員在葡萄抗鹽堿方面作用明顯。Gang等[24]發(fā) 現(xiàn) 除Vv MAPK14、Vv MAPK31和Vv MAPK41外,其他基因至少可以響應(yīng)一種逆境脅迫。Vv MAPK12、Vv MAPK1、Vv MAPK10、Vv MAPK17、Vv MAPK26、Vv MAPK32和Vv MAPK21分別響應(yīng)光和水楊酸脅迫,Vv MAPK21、Vv MAPK18和Vv MAPK19能夠響應(yīng)9種脅迫,Vv MAPK23受到光脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。本研究中Vv MAPK9、Vv MAPK27和Vv MAPK29、Vv MAPK38和Vv MAPK42在200 mmol·L-1NaCl、500μmol·L-1ABA和10%PEG處理后表達(dá)水平均顯著上調(diào),Vv MAPK13、Vv MAPK24、Vv MAPK26、Vv MAPK35和Vv MAPK41在500μmol·L-1ABA和10%PEG處理后表達(dá)均顯著下調(diào),不同的基因?qū)Ψ巧锩{迫響應(yīng)也不盡相同。芯片數(shù)據(jù)顯示,ABA處理后Vv MAPK5和Vv MAPK7在ABA處理后表達(dá)量明顯下調(diào),Vv MAPK9敏感響應(yīng)NaCl和PEG脅迫,與本研究結(jié)果一致。Vv MAPK12、Vv MAPK16和Vv MAPK22在PEG處理后芯片表達(dá)數(shù)據(jù)和qRT-PCR結(jié)果不同,造成差異的主要原因可能與試驗(yàn)材料的生長(zhǎng)狀況、條件和品種有關(guān),本研究主要以試管苗為研究材料,在生理狀態(tài)上和室外生長(zhǎng)的苗木有較大的差別,從而影響到試驗(yàn)結(jié)果。

綜上,在葡萄基因組中檢索獲得43個(gè)MAPK成員,并且大多數(shù)受到200 mmol·L-1NaCl的誘導(dǎo),表達(dá)水平較對(duì)照上調(diào)顯著,Vv MAPK9、Vv MAPK27、Vv MAPK29和VvMAPK38在500μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1NaCl和10%PEG處理后均上調(diào)表達(dá)顯著,對(duì)3種非生物脅迫的響應(yīng)強(qiáng)烈。