促進(jìn)水稻耐鹽堿細(xì)菌S4菌株的篩選鑒定及其效果研究

李 壯,吳凱華,齊玉璽,季鴻飛,張慧兄,劉 艷,楊國平,,3,張 琇,3

(1.北方民族大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,銀川 750021;2.寧夏五豐農(nóng)業(yè)科技有限公司,銀川 750021;3.寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室,銀川 750021)

隨著經(jīng)濟(jì)和社會的發(fā)展,國內(nèi)人口基數(shù)不斷增大,與不斷減少的耕地之間矛盾愈加突出,糧食安全問題已經(jīng)成為國家戰(zhàn)略安全問題[1-2]。中國約有4.5億畝水稻田,水稻作為中國人最重要的糧食作物,在農(nóng)業(yè)發(fā)展和糧食安全上一直占據(jù)重要地位[3]。水稻田面積的減少和次生鹽漬化嚴(yán)重威脅中國的糧食安全,故人們開始將目光轉(zhuǎn)向在鹽堿地這一重要的潛在土地資源上種植水稻[4-5]。中國約有3.6×107hm2鹽堿地和2.0×106hm2沿海灘涂[6-7],大力開展耐鹽堿水稻(俗稱海水稻)的育種和在沿海灘涂地帶以及內(nèi)陸鹽堿地上試種耐鹽堿水稻,便是中國利用鹽堿地資源和解決糧食問題的新嘗試。

自然界中存在可刺激植物提升抗逆(如鹽堿、干旱、洪澇、凍害等)能力的根際微生物和內(nèi)生微生物[8-12],但人們對這些特殊微生物知之甚少。近年來,植物耐鹽堿研究大多局限于植物對鹽堿脅迫的生理生化反應(yīng),例如在鹽堿脅迫下植物的過氧化氫酶活性升高、積累某些氨基酸等,這些研究只涉及植物和鹽堿等方面[13-14]。而微生物的接種可使不耐鹽堿的植物提升一定的耐鹽堿能力,形成獨特的“植物-微生物-鹽堿”模式,而這三方面的相互作用鮮見報道。此外,如何高效篩選更多有效促進(jìn)植物耐鹽堿的菌株,并揭示此類微生物提高植物耐受能力作用機(jī)理的研究更為欠缺。本研究通過模擬自然界鹽堿脅迫條件,篩選增強(qiáng)水稻在鹽堿脅迫下生長能力的微生物,通過接種微生物,開辟在不改變鹽堿地的情況下仍可讓作物生長良好的新型鹽堿地利用模式,避免傳統(tǒng)鹽堿地治理方法的高投入低回報弊端,其具有較大的商業(yè)應(yīng)用價值,并為提高鹽堿地資源的利用、解決人口與耕地間的矛盾提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物品種 水稻(Oryza sativaL.)品種為耐鹽堿水稻‘湘兩優(yōu)900’(由湖南年豐種業(yè)公司提供,特此感謝)。

1.1.2 土壤樣品采集 土壤樣品取自寧夏回族自治區(qū)鹽堿地不同植物根系(表1)。

表1 土樣取樣地基本情況Table 1 Basic information of sampling sites

1.1.3 植物營養(yǎng)母液的配置(1 000×) 植物營養(yǎng)母液的配置參照劉環(huán)等[15]的方法。

母液各取1 m L加入少量蒸餾水中定容至1 000 m L,1×105Pa滅菌20 min即為常規(guī)植物營養(yǎng)液。

1.1.4 鹽堿脅迫營養(yǎng)液 在常規(guī)植物營養(yǎng)液中加入5.50 g NaCl,經(jīng)1×105Pa滅菌20 min后,加入適當(dāng)濃度經(jīng)滅菌的Na2CO3溶液,調(diào)節(jié)p H至8.5,即為鹽堿脅迫營養(yǎng)液。

1.1.5 TSN固體培養(yǎng)基 胰蛋白胨1.70 g,大豆蛋白胨0.33 g,氯化鈉5.5 g,磷酸氫二鉀0.25 g,葡萄糖0.25 g,蒸餾水1 000 m L,瓊脂12.0 g,經(jīng)1×105Pa滅菌20 min。

1.1.6 DTSA培養(yǎng)基 胰蛋白胨1.70 g,大豆蛋白胨0.33 g,磷酸氫二鉀0.25 g,葡萄糖0.25 g,瓊脂12.0 g,蒸餾水1 000 m L,經(jīng)1×105Pa滅菌20 min。

1.1.7 DTSB培養(yǎng)基 胰蛋白胨1.70 g,大豆蛋白胨0.33 g,磷酸氫二鉀0.25 g,葡萄糖0.25 g,蒸餾水1 000 m L,經(jīng)1×105Pa滅菌20 min。

1.1.8 初篩培養(yǎng)基 常規(guī)植物營養(yǎng)培養(yǎng)基:常規(guī)植物營養(yǎng)液中加入6.5 g/L瓊脂,1×105Pa滅菌20 min;鹽堿脅迫培養(yǎng)基:鹽堿脅迫營養(yǎng)液中加入6.5 g/L瓊脂,1×105Pa滅菌20 min,凝固前加入適量滅菌的Na2CO3溶液即為鹽含量0.60%,p H 8.5的鹽堿脅迫培養(yǎng)基。

1.1.9 催芽培養(yǎng)基 瓊脂6.5 g,蒸餾水1 000 m L,經(jīng)1×105Pa滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株分離純化 分別取表1中10 g根際土壤碾碎后加入裝有90 m L蒸餾水的燒杯中,振蕩30 min,取懸濁液逐級梯度稀釋,將適宜濃度的稀釋液涂布于TSN固體培養(yǎng)基平板上,28℃倒置培養(yǎng)24～72 h,挑取各分離物劃線純化3次,獲得純化菌株保存于4℃,備用。

1.2.2 種子催芽 取大小均一、顆粒飽滿無破損的水稻種子經(jīng)55℃、10 min熱處理后,在超凈工作臺中用無水乙醇浸泡5 s,用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒30 s,再用無菌水沖洗6次。均勻擺放于催芽培養(yǎng)基上,于28℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d萌發(fā),待水稻幼芽長至0.5～1.0 cm,備用。

1.2.3 初篩 通過鹽堿脅迫平板篩選可刺激水稻幼苗耐鹽堿的菌株,設(shè)置3種處理,無鹽堿脅迫對照CK0:催芽后的種子均勻擺放于常規(guī)植物營養(yǎng)培養(yǎng)基上;鹽堿脅迫對照CK1:催芽后的種子均勻擺放于鹽堿脅迫培養(yǎng)基上;測試處理:催芽后的種子用待測菌株配置的菌懸液浸泡1 min后均勻擺放在鹽堿脅迫培養(yǎng)基上,菌懸液濃度為1×108cfu/m L。每平板25粒種子,每處理設(shè)置3個重復(fù),置于光照培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)方式參照表2。

1.2.4 復(fù)篩 水培法篩選可提高促進(jìn)水稻耐鹽堿能力的菌株:水稻種子催芽后挑選長勢均一的水稻幼芽,均勻擺放在盛有300 g白色鵝卵石(直徑0.4～0.7 cm)經(jīng)1×105Pa滅菌20 min的植物培養(yǎng)瓶中,各培養(yǎng)瓶中加入60 m L植物營養(yǎng)液,并在每瓶擺放25粒水稻幼芽。CK0:常規(guī)植物營養(yǎng)液,不接菌處理;CK1:鹽堿脅迫營養(yǎng)液,不接菌處理;測試組:鹽堿脅迫培養(yǎng)基,種子浸泡于1×108cfu/m L濃度的待試菌懸液1 min后種植。

每處理設(shè)置3個重復(fù),放置光照培養(yǎng)箱中,按表2方式培養(yǎng),每天測定并矯正營養(yǎng)液鹽度和p H,14 d后采集水稻幼苗株高、根長和鮮質(zhì)量等生長指標(biāo),篩選出可顯著提升水稻耐鹽堿能力的菌株。

表2 水稻幼苗培養(yǎng)條件Table 2 Cultivation condition of rice seedlings

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 培養(yǎng)特征和形態(tài)特征觀察 將S4菌株劃線接種在TSN培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)72 h后觀察記錄單菌落形態(tài),并采用革蘭氏染色法觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 分子鑒定 將S4菌株送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測定16S r RNA序列,根據(jù)同源性進(jìn)行菌株鑒定。

1.3.3 S4菌株生長曲線的測定 將S4菌株劃線接種在DTSA培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落用無菌水制成1×108cfu/m L菌懸液,取1 m L菌懸液,加入裝有100 m L DTSB培養(yǎng)液的250 m L錐形瓶中,180 r/min,28℃振蕩培養(yǎng),每隔2 h取樣。在600 nm下(以不接菌DTSB培養(yǎng)液為空白對照)測定吸光值。

1.3.4 S4菌株對鹽、堿、高溫耐受性 將S4菌株劃線接種在DTSA斜面上,28℃培養(yǎng)24 h。

用無菌水制成1×108cfu/m L菌懸液,取1 m L菌懸液分別加入裝有100 m L含有0、5%、10%、15%、20%、25% NaCl的DTSB培養(yǎng)液的250 m L錐形瓶中,180 r/min,28℃振蕩培養(yǎng)72 h,在600 nm下(以不接菌培養(yǎng)液為空白對照)測定吸光值。

用無菌水制成1×108cfu/m L菌懸液,取1 m L菌懸液,加入裝有100 m L DTSB培養(yǎng)液的250 m L錐形瓶中,p H分別調(diào)節(jié)為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0,180 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)72 h,在600 nm波長條件下以不接菌培養(yǎng)液為空白對照測定吸光值。

用無菌水制成1×108cfu/m L菌懸液,取1 m L菌懸液加入裝有100 m L DTSB培養(yǎng)液的250 m L錐形瓶中,180 r/min,分別置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃條 件 下 振 蕩 培 養(yǎng)72 h,在600 nm波長下(以不接菌培養(yǎng)液為空白對照)測定吸光值。

1.4 大田試驗

試驗區(qū)位于寧夏銀川市西夏區(qū)賀蘭山西路蘆花村(108°9′13″E、38°34′45″N,海拔111 7 m)。采用旱育稀植和全程機(jī)械化栽培,以常規(guī)方式進(jìn)行底肥、分蘗肥、穗肥和粒肥的施加。試驗設(shè)置2個處理,測試組:S4菌劑拌種+常規(guī)管理;對照組:常規(guī)管理。各組設(shè)置6個重復(fù),共計12個小區(qū),小區(qū)面積13 225 m2(115 m×115 m),小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列,小區(qū)間打埂隔離。

1.4.1 試驗區(qū)肥力指標(biāo)檢測 主要檢測總有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效磷、速效鉀、土壤鹽分和p H等對水稻生長有重要影響的指標(biāo),檢測方法參照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1121-2006、NY/T 53-1987和NY/T 889-2004等。

1.4.2 S4菌株在鹽堿土中對水稻生長的影響收獲期每小區(qū)隨機(jī)選取50株水稻植株,對株高、分蘗數(shù)、劍葉長度等生長指標(biāo)和單穗質(zhì)量、有效穗數(shù)、千粒質(zhì)量等產(chǎn)量指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016和Graphpad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計,5%顯著水平,并用Microsoft Excel 2016進(jìn)行繪圖,數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 促進(jìn)水稻耐鹽堿菌的篩選

從植物根際土壤和植物組織中分離得到450株細(xì)菌、放線菌,共篩選出效果較為明顯且穩(wěn)定的6株供試菌株。在鹽堿脅迫條件下分別接種6種菌株相對于對照組(不接種菌株),水稻幼苗的株高、根長、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均有不同程度的提升,說明上述6株菌株對水稻幼苗在鹽堿環(huán)境的生長具有促進(jìn)作用,可不同程度地提升水稻幼苗對鹽堿脅迫的抵御能力(表3)。通過3次重復(fù)共培養(yǎng)試驗,發(fā)現(xiàn)菌株S4對鹽堿脅迫下水稻幼苗生長的 促生效果最為顯著而穩(wěn)定(圖1)。

表3 接種菌株14 d后水稻幼苗生長狀況Table 3 Growth status of rice seedlings after strains inoculation for 14 days

圖1 不同處理下水稻幼苗生長情況對比Fig.1 Comparison of growth of rice seedlings under different treatments

2.2 菌株S4的鑒定

2.2.1 培養(yǎng)特征和形態(tài)學(xué)觀察 S4菌株在TSN培養(yǎng)基上的菌落為圓形,直徑1.5 mm,菌落顏色因培養(yǎng)條件不同而變化,在黑暗條件下生長的菌落為乳白色,在光照條件下培養(yǎng)的菌落為淡黃色,表面光滑有光澤,有粘性易挑起。菌落切面隆起,不透明,邊緣完整或波狀(圖2-A、圖2-B),為革蘭氏陽性菌(圖2-C)。

圖2 S4菌株的菌落形態(tài)和菌株特征Fig.2 Colony morphology of strain S4

2.2.2 菌株S4分子鑒定 根據(jù)16S r RNA鑒定,S4菌株為人參土微桿菌(Microbacterium ginsengiterrae),相似性達(dá)99.14%,獲得序列號NR116483.1。

2.2.3 菌株S4生長曲線 隨著培養(yǎng)時間的增加,S4菌株的OD600在0～14 h增加緩慢,即菌體數(shù)增加緩慢;而在16～20 h,S4菌株的OD600呈現(xiàn)指數(shù)增長趨勢,表明此時菌體增長量大,活力最旺盛,在其生長期內(nèi)此時期最適宜對種子進(jìn)行接種(圖3)。

圖3 菌株S4生長曲線(n=3)Fig.3 Growth curve of strain S4(n=3)

2.2.4 菌株S4對鹽、堿及高溫的耐受能力 經(jīng)試驗測定(圖4),S4菌株在鹽含量達(dá)到4.0%時生長狀態(tài)最為良好,而其最大耐鹽含量為5.0%;p H在9.5時生長最佳,但p H達(dá)到10.5時無法生長;最適生長溫度在30～31℃,最高耐受溫度為50℃。

圖4 S4菌株對逆境的耐受能力(n=3)Fig.4 Tolerance of strain S4 to adverse conditions(n=3)

2.3 S4菌株對水稻植株在鹽堿土中生長的影響

2.3.1 試驗區(qū)肥力指標(biāo)檢測 試驗區(qū)土壤肥力指標(biāo)中有機(jī)質(zhì)和全氮含量較高,參照全國第2次土壤普查推薦的土壤肥力分級標(biāo)準(zhǔn),速效氮、速效磷和速效鉀含量為第3級,表明土壤肥力較好,但鹽分和p H較高,對作物生長不利(表4)。

表4 田間試驗區(qū)土壤肥力指標(biāo)Table 4 Soil fertility index in field of trial area

2.3.2 S4菌株在鹽堿土中對水稻生長的影響與對照組相比,施用S4菌劑對水稻植株劍葉長度的促進(jìn)作用不顯著,但在株高、分蘗數(shù)、穗長和地上部分干質(zhì)量等生長指標(biāo)方面分別提高8.46%、72.91%、12.74%和66.85%,而在單穗質(zhì)量、有效穗數(shù)、穗粒質(zhì)量、出谷率、千粒質(zhì)量和理論畝產(chǎn)等產(chǎn)量指標(biāo)方面,相對對照組水稻植株分別提高13.33%、18.31%、18.43%、5.24%和10.79%(圖5、表5、表6)。

表5 施用S4菌劑后水稻植株生長狀況Table 5 Growth status of rice after application of S4 inoculum

表6 施用S4菌劑后水稻產(chǎn)量指標(biāo)變化Table 6 Changes of rice yield indexes after application of S4 inoculum

圖5 不同育苗方式下水稻生長狀況對比Fig.5 Comparison of rice growth status with different seedling raising methods

3 討論

近年來,通過微生物方法改良土壤鹽漬化已成為人們關(guān)注的熱點,但通過微生物刺激提高水稻耐鹽堿能力的研究鮮見報道,主要集中在芽孢桿菌、沙雷氏菌和腸桿菌等的研究,且多為先通過研究鹽堿的抗性與溶磷、產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)和ACC脫氨酶活性能力對菌株進(jìn)行初步篩選,再與植物互作篩選可提高水稻耐鹽堿能力的菌株,方法較為復(fù)雜,同時可能遺漏單獨存在時無抗鹽堿或產(chǎn)酶能力,但與植物互作時可提高雙方耐鹽堿能力的菌株。

楊美英等[16]研究發(fā)現(xiàn)可溶磷的沙雷氏菌和腸桿菌的加入可提高水稻根、莖、葉中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的增加,并能提高水稻產(chǎn)量;謝金宏[17]發(fā)現(xiàn)一株沙雷氏菌和一株巨大芽孢桿菌均可降解難溶磷,提高水稻在鹽堿地中的生長能力;韓笑[18]研究發(fā)現(xiàn)一株腸桿菌的加入可通過增大溶磷量、產(chǎn)吲哚乙酸等方式提高水稻種子在鹽堿脅迫下的發(fā)芽率和水稻幼苗的生長能力。而本研究采用的兩步篩選法,首先使用平板初篩可高效便捷地篩選出能有效提高水稻耐鹽堿能力的菌株,再進(jìn)行培養(yǎng)瓶水培試驗復(fù)篩,在更加符合水稻生長規(guī)律的培養(yǎng)條件下,進(jìn)一步驗證供試菌株對水稻耐鹽堿能力提升的效果和穩(wěn)定性,方法簡便,值得推廣使用。

本研究通過微生物刺激提高水稻耐鹽堿能力具有經(jīng)濟(jì)高效、節(jié)約能源、效果穩(wěn)定等優(yōu)點,同時是對鹽堿地資源的有效利用,且無污染,對環(huán)境友好型、資源節(jié)約型生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重大意義[19-21]。耐鹽堿水稻的研究提高中國糧食產(chǎn)量,是解決人民溫飽問題最有力途徑之一,對鹽堿地資源的有效利用和在一定程度上解決人地矛盾也有較為重要的意義[22]。而S4菌株的加入明顯提高了耐鹽堿水稻在鹽堿脅迫下的生長能力和產(chǎn)量。并且S4菌株可在鹽含量4.0%時正常生長,能夠耐受高達(dá)9.5的堿性p H,表明該菌株具有良好的商業(yè)應(yīng)用潛力,對耐鹽堿水稻的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和鹽堿地資源的利用有較大作用。

S4菌株刺激水稻提高耐鹽堿能力的具體作用物質(zhì)及其機(jī)理尚不明確,為了進(jìn)一步發(fā)揮S4菌株的潛力,需要進(jìn)一步研究探討其作用機(jī)理以及最佳施用條件。