甜菜M14品系短期鹽脅迫下生理生化指標(biāo)研究

賈姍姍，潘 鈺，馬春泉，于 冰，陳思學(xué)，李海英

（黑龍江大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150080）

0 引 言

土壤鹽漬化問題一直是困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴(yán)重問題。由于我國人口多，可利用的耕地面積少，隨著鹽漬化問題的加重，糧食問題已成為我們現(xiàn)在面對的頭等問題[1]。

植物在正常的生長條件下，植物本身就有可能產(chǎn)生活性氧等物質(zhì)，如果外界環(huán)境沒有明顯的變化，植物自身的活性氧的產(chǎn)生與清除維持著一定的平衡，這時(shí)，植物不會受到活性氧等物質(zhì)的傷害，可以正常生長發(fā)育[2]。如果植物所處的環(huán)境突然間發(fā)生變化，例如鹽漬化等逆境，植物的內(nèi)部環(huán)境的平衡就會被打破，這樣活性氧的產(chǎn)生增多，而植物的清除機(jī)制卻不能及時(shí)清除活性氧，最后導(dǎo)致植物的質(zhì)膜受到活性氧的傷害，離子外滲，同時(shí)MDA含量增多，植物代謝紊亂，最終影響植物的生長乃至死亡[3－5]。

植物為了適應(yīng)逆境，就會進(jìn)化出一套植物耐鹽機(jī)制，包括植物自身結(jié)構(gòu)及器官功能特性對鹽分的適應(yīng)、合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、離子調(diào)節(jié)、活性氧清除機(jī)制等方面。離子調(diào)節(jié)包括選擇性吸收離子，或者將已經(jīng)吸收細(xì)胞的離子外排出體外，亦或者將離子區(qū)域化于液泡或者老葉防止對植物新葉產(chǎn)生傷害；保護(hù)酶包括SOD、POD、CAT這3種酶相輔相成的來清除植物體內(nèi)的活性氧；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括吸收積累無機(jī)鹽離子、合成積累有機(jī)小分子物質(zhì)如脯氨酸等[6－8]。

野生白 花甜菜（Beta corolliflora Zoss.）具有良好的抗旱性，耐寒抗霜性，耐鹽性和無融合生殖等優(yōu)良特性。甜菜M14品系是二倍體栽培甜菜（Beta vulgaris L.）和四倍體野生白花甜菜（Beta corolliflora Zoss.）通過遠(yuǎn)緣雜交獲得的帶有野生白花甜菜第9號染色體的單體附加系。前期的研究工作表明，甜菜M14品系具有野生白花甜菜的一些優(yōu)良性狀，如抗逆性，可以忍受NaCl濃度500mmol／L[9－12]。本試驗(yàn)就是研究甜菜 M14品系在不同鹽濃度脅迫下短期的生理生化反應(yīng)的變化過程，以此來揭示植物的抗逆規(guī)律，為今后進(jìn)一步研究甜菜M14品系的其他抗逆研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

甜菜 M14品系（Chromosome 9monosomic addition line of Beta corolliflora Zoss.in Beta vulgaris L.，VV＋C9，2n＝18＋1），其染色體組成中除了包含18條栽培甜菜染色體外，還附加有白花甜菜第9號染色體。

1.2 甜菜培養(yǎng)與處理

挑選甜菜M14品系飽滿的種子，播種于盛有蛭石的發(fā)芽盒中，7d以后將其移入內(nèi)部盛有霍格蘭營養(yǎng)液的黑色不透明的槽子中，以泡沫為支持物每孔3棵苗，當(dāng)植株能夠在新環(huán)境中正常生長時(shí)留取長勢好的幼苗（保證每孔1顆苗），當(dāng)植株長到7d，挑選長勢一致的幼苗分到4孔的黑色不透明的盛有霍格蘭營養(yǎng)液小槽子中準(zhǔn)備進(jìn)行脅迫處理。當(dāng)植株生長穩(wěn)定時(shí)每天加NaCl脅迫處理使其終濃度分別達(dá)到200、400mmol／L，以空白為對照，分別于1、2、3、5、7d進(jìn)行采樣保存，測植物的質(zhì)膜透性、MDA含量、脯氨酸含量等物質(zhì)。

1.3 質(zhì)膜透性測定

稱取甜菜M14品系葉片0.5g于洗凈的小燒杯中，用ddH2O將其洗凈，再加入15mL ddH2O振蕩使葉片全部沉沒，然后將其放在真空干燥箱中抽走葉片細(xì)胞間的空氣使葉片完全萎蔫并浸泡在水中，取出冷卻后常溫下測電導(dǎo)率E1，煮沸10min后冷卻至室溫后測電導(dǎo)率E2，計(jì)算葉片相對電導(dǎo)率（%）＝E1／E2。

1.4 MDA含量測定

稱取甜菜 M14品系葉片0.5g，加入少量TCA進(jìn)行研磨，最后定容至10mL，放入100℃水浴中煮沸10min，取出冷卻，測量溶液450nm、532nm和600nm處的吸光度。計(jì)算MDA濃度C（μmol／L） ＝6.45（A532－ A600） －0.56A450；MDA含量（μmol／g）＝C（μmol／L）×上清液總體積（mL）／樣品鮮重（g）×1000。

1.5 脯氨酸含量測定

稱取甜菜M14品系葉片1g，加入少量80%的乙醇研磨，將研磨液轉(zhuǎn)移至10mL管子中，使溶液終體積為10mL，封口膜封好于暗室中浸提24h，然后在有活性炭的濾紙上進(jìn)行過濾，去除殘?jiān)?，離心備用。取上清液2mL于管子中，加入2 mL冰醋酸和2mL茚三酮試劑，封口膜封住，沸水浴10min，冷卻后測定515nm處的吸光度。計(jì)算：

式中C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的脯氨酸的質(zhì)量，μg；VT為提取液總體積，mL；V1為測定液體積，mL；W 為樣品質(zhì)量，g。

1.6 可溶性蛋白質(zhì)含量測定

稱取甜菜M14品系葉片0.5g，加入5mL蒸餾水進(jìn)行研磨，研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管中離心備用。吸取上清液1mL加入5mL考馬斯亮藍(lán)后搖勻放置10min，然后在595nm下比色，

式中C為查得標(biāo)準(zhǔn)曲線值，μg；VT為提取液總體積，mL；WF為樣品鮮重，g；VS為測定時(shí)加樣量，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜M14品系葉片相對電導(dǎo)率的變化

甜菜M14品系葉片相對電導(dǎo)率的變化見圖1。

圖1 葉片相對電導(dǎo)率Fig.1 Relative conductivity of leaves

由圖1可見，隨著NaCl處理時(shí)間的延長，0、200、400mmol／L NaCl脅迫處理下的甜菜M14品系的葉片相對電導(dǎo)率整體呈上升趨勢，并且均在脅迫處理后的7d達(dá)到最高，在1、2、3、5dNaCl脅迫處理后的甜菜M14品系葉片的相對電導(dǎo)率與對照相比，在200、400mmol／L處理下相對比較高，而在7d脅迫處理后與對照相比，相差不大，趨于穩(wěn)定。

2.2 甜菜M14品系葉片MDA含量的變化

甜菜M14品系葉片MDA含量的變化見圖2。

圖2 葉片MDA含量Fig.2 MDA content of leaves

由圖2可見，隨著NaCl脅迫處理時(shí)間的延長，與對照相比，甜菜 M14品系在200、400 mmol／L NaCl脅迫下的MDA含量隨著時(shí)間的延長整體呈下降趨勢，而對照相對來說是升高的；甜菜M14品系在200mmol／L NaCl脅迫處理下葉片的MDA含量在脅迫處理后的2d達(dá)到最低，而在400mmol／L NaCl脅迫處理下葉片的MDA含量在脅迫處理后的7d達(dá)到最低。

2.3 甜菜M14品系葉片脯氨酸含量的變化

甜菜M14品系葉片脯氨酸含量的變化見圖3。

圖3 葉片脯氨酸含量Fig.3 Proline content of leaves

由圖3可見，甜菜M14品系葉片的脯氨酸含量隨著不同濃度（0、200、400mmol／L）鹽脅迫時(shí)間的延長整體呈下降趨勢并且均在7d達(dá)到最低。

2.4 甜菜M14品系葉片可溶性蛋白質(zhì)的變化

甜菜M14品系葉片可溶性蛋白質(zhì)的變化見圖4。

圖4 葉片可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein content

由圖4可見，與對照相比，200、400mmol／L NaCl脅迫處理后的甜菜M14品系葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量隨著鹽脅迫時(shí)間的延長未有明顯變化，可溶性蛋白質(zhì)含量在400mmol／L NaCl脅迫處理后比對照組高些，而200mmol／L NaCl脅迫處理后的可溶性蛋白質(zhì)含量在處理后的1、2d略低于對照組，在3、5、7d脅迫處理后略高于對照組。

3 討 論

通過對試驗(yàn)結(jié)果分析得出，隨著鹽濃度的增大，甜菜M14品系葉片的電導(dǎo)率逐漸增大，細(xì)胞的質(zhì)膜透性在鹽脅迫下逐漸增大，但增加的幅度并不明顯，而且同一濃度鹽脅迫處理下隨著時(shí)間的延長植物細(xì)胞的電導(dǎo)率也在逐漸增大，并且在處理后的7d達(dá)到最高，同時(shí)結(jié)合MDA含量隨著鹽濃度的增加及鹽脅迫時(shí)間的延長，整體呈現(xiàn)下降趨勢，也就是植物在逆境下迅速啟動了保護(hù)系統(tǒng)來防止植物進(jìn)一步被鹽傷害；通過測定的脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量可以看出，鹽脅迫下最先響應(yīng)的是脯氨酸，而可溶性蛋白質(zhì)含量增幅不大。由此可以得出，甜菜M14品系可以在400mmol／L NaCl脅迫下生長良好。

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