球孢白僵菌不同分離株對西花薊馬的毒力測定

陳 斌，張 琦，桂富榮，何永紅，劉云龍，李正躍，肖關(guān)麗云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，生物多樣性研究與應(yīng)用技術(shù)國家工程中心，農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，云南昆明6500;云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明6500

西花薊馬Frankliniella occidentals(Pergande)是一種重要的農(nóng)林植物害蟲(呂要斌等，2004;吳青君等，2005)，其個體小，寄主植物廣泛，發(fā)生隱蔽，已對多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生一定的抗性(Immaraju et al.，1992)。充分發(fā)揮天敵資源的作用，采用環(huán)境友好型的防治措施一直是建立西花薊馬防控體系和開展綜合治理研究的重要內(nèi)容(Hall，1992)。

蟲生真菌能在自然條件下通過體壁直接侵染昆蟲(蒲哲龍和李增智，1996)，并能在自然條件下引發(fā)害蟲的流行病，因而已成為害蟲生物防治的重要手段之一。西花薊馬的寄生真菌有5種(張琦等，2010)，包括蠟蚧輪枝菌 Lecanicillium lecanii(Zimm.)(Saito，1992;Scott＆ Ronald，2002)、球孢白僵菌Beauveria bassiana(Balsama)Villemin(Maniania et al.，2003;Saito，1992)、金龜子綠僵菌 Metarizium anisopliae(Metsch)Somk(Lindquist，1996;Maniania et al.，2003)、玫煙色擬青霉 Paecilomyces fumeroseus(Wize)Brown ＆ Smith(Saito et al.，1989)、小孢新接霉Neozygites parvispora(Macleod＆Carl)(Montserrat et al.，1998)。

近年來，有關(guān)蟲生真菌對西花薊馬的毒力及控制效果的研究逐漸受到重視(張素華等，2009)。國外一些研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌和綠僵菌對西花薊馬具有較強(qiáng)的致病性和控制作用(Goodwin＆Steiner，1996;Gouli et al.，2008;Maniania et al.，2003;Shigeyuki et al.，2011);張素華等(2009)研究也發(fā)現(xiàn)，白僵菌對西花薊馬具有一定的致病力。本研究選用分離自不同寄主昆蟲體上的球孢白僵菌菌株，以室內(nèi)生測法研究其對西花薊馬的毒力，以期為西花薊馬的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

從田間采集西花薊馬，置于室內(nèi)智能人工氣候箱［(25±1) ℃，16L∶8D］中，用四季豆 Phaseolus vulgaris L.飼養(yǎng)，建立和擴(kuò)大其種群，連續(xù)飼養(yǎng)至第3代成蟲供試。

1.2 供試菌種

供試8個菌株分別采自云南省不同地區(qū)的罹病蟲體，分離培養(yǎng)后，根據(jù)分生孢子、菌絲等形態(tài)進(jìn)行菌種的種類鑒定(蒲哲龍和李增智，1996)，具體的采集地點及其原始寄主見表1。各菌株均保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲病原體實驗室。

表1 供試球孢白僵菌菌株來源一覽表Table 1 The host species and geographical origin of B.bassiana isolates studied

1.3 孢子懸浮液的配制

將球孢白僵菌菌株接種于SDAY(葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL)平板培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。待大量產(chǎn)孢后，刮取孢子粉，用含0.1%吐溫-80濕潤劑的磷酸緩沖液(0.003 mol·L-1KH2PO4，pH 7.0)配制分散均勻的孢子懸液，其濃度分別為1.25×104、1.25 ×105、1.25 ×106、1.25 ×107、1.25 ×108個·mL-1，備用。

1.4 生物測定

選取7日齡薊馬成蟲作為供試種群，每個培養(yǎng)皿(直徑12 cm，放1張濾紙)放置30頭，再在培養(yǎng)皿中放置3根四季豆。采用噴霧法(Jennifer et al.，2009)接種，每個處理設(shè)3次重復(fù)，以含0.1%吐溫-80濕潤劑的0.003 mol·L-1磷酸緩沖液為空白對照，同時用無菌水保持濾紙濕潤。在培養(yǎng)皿上覆以扎有適量小孔的保鮮膜。置于光照培養(yǎng)箱(25℃、RH 85%、光周期16L∶8D)中飼養(yǎng)，每24 h觀察、記錄1次死亡蟲體，連續(xù)記錄10 d并將死亡個體放入滅菌培養(yǎng)皿中，置于相同條件的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、觀察，以確定死亡原因，將長出菌絲的蟲體計為有效感染。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)CLL模型(時間—劑量—死亡率)處理生物測定數(shù)據(jù)(唐啟義和馮明光，2002)。采用Duncan's新復(fù)極差多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析。采用幾率值分析法，以時間(d)的對數(shù)值為X，死亡率的幾率值為Y，計算毒力回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對西花薊馬致死的毒力參數(shù)值

供試球孢白僵菌菌株BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbSM090521、BbYY090613、BbMZ051230接種處理后第1天，西花薊馬活躍性降低，行動遲緩，開始死亡，根據(jù)DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)CLL模型計算出各菌株侵染致病的劑量效應(yīng)參數(shù)值，分別為 1.43、0.87、0.93、0.98、1.23、0.92、1.07、0.86，表明各菌株對西花薊馬成蟲均具有致病性。其中，BbKM030716和BbXW060615的毒力強(qiáng)于其他菌株。

2.2 西花薊馬感染不同菌株后的校正死亡率

在1.25×104～1.25 ×108個·mL-1孢子濃度下，經(jīng)菌株 BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbYY090613、BbSM090521、BbMZ051230 處理的西花薊馬在接種后3～5 d達(dá)到死亡高峰，其校正死亡率隨接種時間的延長而增大，連續(xù)10 d內(nèi)校正死亡率分別為 44.13% ～ 98.49%、12.63% ～78.90%、30.36% ～ 96.92%、51.36% ～ 98.74%、26.14%～98.59%、7.27% ～78.71%、49.06% ～98.74%、27.67 ～87.36%。在高劑量1.25 ×107和1.25 ×108個·mL-1的孢子濃度下，薊馬最早于第1天死亡，最遲于第2天死亡，且校正死亡率上升速度因菌株而不同，BbKM030716和BbJS080625感染的薊馬的死亡率上升最快。西花薊馬接種 BbCG051229、BbSM090521和BbMZ051230后第10天的校正死亡率低于90%，分別為(78.90 ± 5.34)%、(78.71 ± 3.34)% 和(87.36 ±3.67)%，接種其他菌株后第10天的校正死亡率均達(dá)95%以 上。這 表 明菌 株 BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615對西花薊馬成蟲具有較強(qiáng)的毒力(圖1)。

2.3 不同菌株對西花薊馬成蟲的致死劑量和致死時間

2.3.1 致死中劑量(LC50)的對數(shù)值 根據(jù)生物測定數(shù)據(jù)的“時間—劑量—死亡率”模擬及參數(shù)估計，得出各菌株對西花薊馬成蟲的LC50的對數(shù)值。結(jié)果表明，接種后1～10 d，各菌株對西花薊馬成蟲侵染致病的LC50的對數(shù)值間差異顯著(F=30.97，P＜0.01)，即LC50的大小因菌株而異(表2)。球孢白僵菌對西花薊馬的致死劑量是時間的函數(shù)，隨著接種時間的延長逐漸減少，表明劑量效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。接種 后 1 ～ 10 d，菌 株 BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbSM090521、BbYY090613、BbMZ051230對西花薊馬成蟲的LC50的對數(shù)值分別為(5.10 ± 0.24) ～ (10.26 ± 1.59)、(7.66 ±1.63) ～ (15.45 ± 1.15)、(5.98 ± 0.25) ～ (10.65 ±0.67)、(6.21 ±0.20) ～ (11.23 ±0.36)、(5.14 ±0.13)～(10.24 ± 1.34)、(6.82 ± 0.13) ～ (12.12 ± 0.68)、(6.19 ± 0.20) ～ (11.03 ± 0.64)、(6.65 ± 0.15) ～(11.46 ± 0.67)，則 LC50分別為 1.29 × 1010～ 1.26 ×107、7.72 ×1011～6.95 ×108、1.88 ×1010～ 5.80 ×107、3.20 ×1010～8.53 ×107、1.27 ×1010～1.28 ×107、6.86× 1010～ 2.18 × 108、2.68 × 1010～ 8.25 × 107、3.91 ×1010～1.69×108個·mL-1孢子濃度。其中，菌株BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615 的LC50低于其他菌株，表明其具有較高毒力。

2.3.2 致死中時(LT50) 由表3可以看出，在1.25×105～1.25 ×108個·mL-1孢子濃度下，不同菌株的 LT50間差異顯著(F=11.33，P ＜ 0.01)。LT50隨孢子濃度的增大而逐漸減小，表明球孢白僵菌對西花薊馬的致死劑量是時間的函數(shù)，隨著處理劑量的增大，各菌株的時間效應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng)。當(dāng)孢子濃度為1.25 ×105～1.25 ×108個·mL-1時，球孢白僵菌菌株 BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbSM090521、BbYY090613、BbMZ051230的 LT50分別為(3.12 ±1.12) ～ (5.64 ±2.17)、(5.39 ±1.22) ～(9.21 ±3.23)、(3.71 ±1.12) ～ (9.81 ± 2.54)、(3.23 ±0.45) ～(6.49 ±2.67)、(3.77 ±0.67) ～ (8.89 ±3.23)、(4.51 ±1.22) ～ (10.75 ±2.37)、(5.35 ±1.12) ～(8.18 ±2.23)、(5.84 ±1.14) ～ (10.61 ±3.56)d。從上述結(jié)果可以看出，在供試菌株中，BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121和BbXW060615對西花薊馬成蟲的LT50最小，說明它們對西花薊馬成蟲的致病性最強(qiáng)。

圖1 各菌株對西花薊馬成蟲的校正死亡率Fig.1 Corrected mortality of F.occidentalis after inoculation of B.bassiana

表2 各菌株對西花薊馬的LC50的對數(shù)值Table 2 Logarithmic value of LC50for B.bassiana isolates against adult thrips after inoculation

表3 各菌株對西花薊馬的LT50Table 3 LT50in days for B.bassiana isolates against adult of F.occidentalis

2.4 毒力回歸方程

對球孢白僵菌菌株 BbKM030716、BbCG051229、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615、BbSM090521、BbYY090613、BbMZ051230的接種劑量與致死時間進(jìn)行回歸分析，獲得各菌株侵染致病的毒力回歸方程(表4)。各菌株的卡方值(X2)分別為 0.458、0.648、1.274、1.877、0.657、1.743、1.895、0.360，這些值均小于 X2分布表中 P=0.05、df=3時的 X2(7.82)，表明回歸方程式可行。

表4 各菌株對西花薊馬的毒力回歸方程Table 4 Characterisation of virulence of various isolates of B.bassiana against F.occidentalis adults

3 討論

本研究采用噴霧法測定了各菌株對西花薊馬成蟲的毒力，以降低傳統(tǒng)浸漬法因浸漬接種時間差異帶來的誤差，對指導(dǎo)田間防治應(yīng)用更有意義。

本研究中，不同寄主來源的球孢白僵菌菌株對西花薊馬成蟲均具有一定的毒力。其中，在1.25×105～1.25×108個·mL-1孢子濃度下，菌株BbKM030706 的 LT50為 3.12 ～ 5.64 d，該結(jié) 果與Shigeyuki et al.(2011)報道的結(jié)果相似。從致死時間效 應(yīng) 來 看，在 8個 菌 株 中，BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121和 BbXW060615的毒力較強(qiáng)，用1.25×108個·mL-1孢子濃度接種后的LT50分別為(3.12 ± 1.12)、(3.71 ± 1.12)、(3.23 ± 0.45) 和(3.77 ± 0.67)d。從 致 死 劑 量 效 應(yīng) 來 看，菌 株BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121 和 BbXW060615接種后1～10 d對西花薊馬成蟲的LC50分別為1.29×1010～1.26 ×107、1.88 ×1010～5.80 ×107、3.20 ×1010～8.53×107和1.27 ×1010～1.28 ×107個·mL-1孢子濃度。從侵染致病校正死亡率來看，經(jīng)菌株BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121、BbXW060615 處理后第10天，西花薊馬的校正死亡率分別為98.49%、96.92%、98.74%、98.59%。綜上所述，菌株BbKM030716、BbJS080625、BbQJ031121 和 BbXW060615對西花薊馬成蟲的毒力較強(qiáng)，可作為西方薊馬生防制劑開發(fā)的潛力菌株。

球孢白僵菌作為一種最常見的昆蟲病原真菌，在害蟲生物防治中受到廣泛關(guān)注(Lacey＆Goettel，1995)。球孢白僵菌菌株的地理來源或寄主來源、菌落形態(tài)、生長速度、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率以及胞外蛋白酶水平等生物學(xué)性狀與菌株的毒力有關(guān)(蔡守平等，2008;何余容等，2004;劉玉軍等，2008;單樂天和馮明光，2006;Montserrat et al.，1998)。同時，不同溫度下，球孢白僵菌對西花薊馬的致病性不同(張素花等，2009)。因此，不同寄主來源的菌株對西花薊馬毒力差異的原因還有待進(jìn)一步研究。

本研究選用的球孢白僵菌菌株在室內(nèi)25℃條件下對西花薊馬成蟲具有較高的毒力，但在自然條件下，感染球孢白僵菌的西花薊馬罹病蟲體很少。因此，關(guān)于球孢白僵菌在田間自然條件下的侵染致病情況有待進(jìn)一步研究。

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