普通環(huán)境下使用生物安全籠盒BSC系統(tǒng)進(jìn)行SPF級(jí)小鼠的繁殖研究

隋世燕，宋艷秋，蔣 梅，顧志明，唐金珍

（1.大理學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，云南大理 671000；2.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；3.大理學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；4.蘇杭科技器材有限公司，江蘇蘇州 215001）

普通環(huán)境下飼養(yǎng)繁殖的動(dòng)物，容易受病原微生物和寄生蟲的侵害，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。在屏障系統(tǒng)內(nèi)繁育無特定病原體（Specific Pathogen-free，SPF）級(jí)大小鼠投資大，建設(shè)周期長，運(yùn)行費(fèi)用高，一些單位無力建設(shè)和使用。而具有微型屏障系統(tǒng)功能的獨(dú)立通氣籠盒（Individually Ventilated Cages，IVC）雖具有節(jié)能環(huán)保、操作方便的功能〔1〕，但I(xiàn)VC在普通環(huán)境內(nèi)使用需要搬運(yùn)到超凈工作臺(tái)內(nèi)給水、給料、換墊料等操作，噴酸消毒作業(yè)對(duì)動(dòng)物影響大，稍有操作不規(guī)范易將籠內(nèi)動(dòng)物污染。而生物安全籠盒（Biological Safety Cage，BSC）是將IVC籠盒飼養(yǎng)在一個(gè)負(fù)壓凈化環(huán)境和生物安全柜內(nèi)，解決了以上存在的難題。

BSC系統(tǒng)由負(fù)壓凈化實(shí)驗(yàn)臺(tái)、獨(dú)立通氣籠盒IVC籠架（小鼠3層×6=18籠）、IVC籠盒、電器控制系統(tǒng)及監(jiān)視系統(tǒng)組成。主要應(yīng)用于生命科學(xué)和生物醫(yī)藥研究，在普通環(huán)境內(nèi)依照嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范操作即可飼養(yǎng)SPF大小鼠開展低危感染性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，一機(jī)二用。實(shí)驗(yàn)人員無須穿戴多層防護(hù)服，實(shí)驗(yàn)過程舒適。具有節(jié)能環(huán)保、保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員的健康與安全，防止人畜共患疾病的發(fā)生，防止動(dòng)物之間交叉感染，保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)〔2-7〕。

本課題探討在普通環(huán)境下使用BSC系統(tǒng)繁育SPF級(jí)小鼠的可行性，摸索其操作規(guī)程，為BSC系統(tǒng)的普及提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 器材與試劑 BSC系統(tǒng)（蘇州蘇杭科技器材有限公司，BSCM18）、高壓消毒鍋（山東淄博新華壓力容器廠）、酶標(biāo)儀（普朗醫(yī)療，型號(hào)：9602A）、加濕器（杭州正島電器設(shè)備有限公司，ZS-40Z型）、抗弓形蟲抗體檢測試劑盒（福建三明藍(lán)波生物技術(shù)研究所，批號(hào)：04070111）、2%過氧乙酸（西安潔立達(dá)精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20090510）、空調(diào)、溫度計(jì)、無菌衣、一次性口罩、手套和帽子等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)小鼠，18～21 g，共60只，雄鼠15只，雌鼠45只，購自第三軍醫(yī)大學(xué)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2007－017，購入后在BSC系統(tǒng)中進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 飼料、墊料、飲水的消毒 飼料、墊料用包裝袋包裝，飲水為自來水，用水瓶分裝，包裝布包裝，經(jīng)121℃高壓蒸氣滅菌30 min。

1.2.2 BSC系統(tǒng)飼育小鼠 購入小鼠使用SPF級(jí)包裝，小鼠到達(dá)前24 h，BSC系統(tǒng)房間全面使用2%過氧乙酸噴霧消毒，前12 h，打開室內(nèi)紫外線燈，小鼠到達(dá)后，鼠盒全面噴霧消毒，BSC系統(tǒng)提前30 min打開紫外線燈，然后在超凈工作臺(tái)上打開小鼠包裝箱，BSC籠盒用15%過氧乙酸全面擦拭表面，將小鼠轉(zhuǎn)入，添加墊料、飲水和飼料，用酒精棉球擦拭通氣孔，將籠盒放回到籠架上。

1.2.3 BSC系統(tǒng)中小鼠的飼養(yǎng)管理及配種 空調(diào)控制溫度在22±2℃，加濕器控制相對(duì)濕度在50±5%；操作前一天室內(nèi)紫外線消毒，每隔3～5 d更換墊料、飲水、籠盒和飼料，超凈工作臺(tái)提前30 min打開紫外線燈，工作人員戴無菌手套，穿無菌消毒服后開始工作。一位工作人員用2%過氧乙酸擦試消毒籠具外表放在超凈工作臺(tái)上，另一名人員打開籠盒，換墊料和飼料，再蓋好蓋子，更換飲水，第一位人員用酒精棉球擦拭通氣孔后將籠盒放入。將引進(jìn)的SPF級(jí)小鼠60只飼養(yǎng)在BSC系統(tǒng)籠盒內(nèi)，每盒3～5只。飼養(yǎng)2個(gè)月后挑出一部分小鼠按雌雄2∶1進(jìn)行配種，記錄分娩時(shí)間。

1.2.4 質(zhì)量檢測 將引進(jìn)的60只SPF級(jí)小鼠分別在飼養(yǎng)1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月時(shí)隨機(jī)選5只進(jìn)行質(zhì)量檢測；子1代小鼠1月齡、2月齡、3月齡時(shí)，分別隨機(jī)選取5只，依照GB14922.2－2001（SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)）要求的項(xiàng)目進(jìn)行質(zhì)量檢測。

體外寄生蟲檢測方法參照GB/T18448.1－2001；弓形蟲檢測使用抗弓形蟲病抗體檢測試劑盒；蠕蟲檢測方法參照GB/T18448.6－2001；鞭毛蟲和纖毛蟲檢測方法參照GB/T18448.10-2001。

沙門菌檢測方法參照GB/T14926.1－2001；支原體檢測使用小鼠支原體ELISA試劑盒；鼠棒狀桿菌檢測使用小鼠棒狀桿菌ELISA試劑盒；泰澤病原體檢測使用小鼠泰澤病原體ELISA試劑盒；嗜肺巴斯德桿菌的檢測方法參照GB/T14926.12-2001；肺炎克雷伯桿菌的檢測方法參照GB/T14926.13-2001；金黃色葡萄球菌的檢測方法參照GB/T14926.14-2001；綠膿桿菌的檢測方法參照GB/T14926.17-2001。

鼠痘病毒檢測使用小鼠鼠痘病毒ELISA試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司）；小鼠肝炎病毒檢測使用小鼠肝炎病毒ELISA試劑盒（北京富眾科技發(fā)展有限公司）；仙臺(tái)病毒檢測使用小鼠仙臺(tái)病毒ELISA試劑盒（上海寶特生命科學(xué)發(fā)展有限公司）；小鼠肺炎病毒使用小鼠肺炎病毒ELISA試劑盒（上海勁馬生物科技有限公司）；呼腸孤病毒Ⅲ型使用小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型ELISA試劑盒（上海豐翔生物科技有限公司）；小鼠細(xì)小病毒使用小鼠細(xì)小病毒ELISA試劑盒（北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司）。

1.3結(jié)果統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)均用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1飼料、墊料、飲水消毒情況高壓蒸汽消毒鍋內(nèi)消毒效果檢測卡顯示消毒物品達(dá)到無菌狀態(tài)。

2.2小鼠妊娠期小鼠妊娠期，見表1。由表1可知，BSC系統(tǒng)飼養(yǎng)小鼠的妊娠期為18.67±0.07 d，約為18.5 d，與普通環(huán)境下使用IVC繁育清潔級(jí)小鼠的妊娠期接近。

表1 小鼠妊娠期

2.3小鼠的初生重、離乳重、窩仔數(shù)和離乳率小鼠的初生重、離乳重、窩仔數(shù)及離乳率，見表2。由表2知，BSC系統(tǒng)飼養(yǎng)小鼠的初生重約為2 g，21 d離乳重14 g左右；BSC系統(tǒng)飼養(yǎng)母鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)平均約為11只，離乳率達(dá)98.5%。

表2 小鼠初生重、離乳重、平均窩產(chǎn)仔數(shù)及離乳率

2.4質(zhì)量檢測共隨機(jī)選出30只小鼠進(jìn)行質(zhì)量檢測，檢測的內(nèi)容包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲，具體項(xiàng)目為沙門菌、支原體、鼠棒狀桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、泰澤病原體、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒、仙臺(tái)病毒、小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、小鼠細(xì)小病毒、體外寄生蟲、弓形蟲、全部蠕蟲、鞭毛蟲和纖毛蟲。結(jié)果全為陰性，說明本實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)的小鼠達(dá)到了SPF級(jí)水平。

3 討論與分析

BSC系統(tǒng)飼養(yǎng)的小鼠產(chǎn)仔數(shù)、離乳率、初生重及離乳重均超過或接近正常屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)的小鼠，小鼠質(zhì)量檢測結(jié)果全為陰性，說明在普通環(huán)境中嚴(yán)格控制條件的情況下，使用BSC系統(tǒng)繁育SPF級(jí)小鼠是完全可行的，它避免了普通環(huán)境下單獨(dú)使用IVC時(shí)籠盒搬運(yùn)到超凈工作臺(tái)時(shí)的動(dòng)物污染，使生產(chǎn)的小鼠能夠達(dá)到SPF級(jí)的要求。

如果BSC籠盒內(nèi)放的小鼠過多，將使更換籠盒的間隔時(shí)間變短，而頻繁更換籠盒容易被病原微生物污染；如果過長時(shí)間更換籠盒，其內(nèi)衛(wèi)生較差，也容易滋生細(xì)菌。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，籠盒在3～5 d需更換一次飲水、墊料和飼料，且每個(gè)籠盒適宜飼養(yǎng)3～5只小鼠。

BSC系統(tǒng)將獨(dú)立通氣籠IVC和生物安全柜有機(jī)地結(jié)合在一起，在一個(gè)負(fù)壓凈化實(shí)驗(yàn)臺(tái)內(nèi)放置多個(gè)獨(dú)立通氣籠盒來飼養(yǎng)SPF大（小）鼠。由于采用單風(fēng)機(jī)（送風(fēng)機(jī)）負(fù)壓凈化技術(shù)同時(shí)提供實(shí)驗(yàn)區(qū)及籠盒內(nèi)潔凈空氣，故使用BSC系統(tǒng)能確保飼養(yǎng)動(dòng)物達(dá)到SPF級(jí)要求。

對(duì)于規(guī)模較小和使用動(dòng)物頻率不高的實(shí)驗(yàn)單位，可建立設(shè)有BSC系統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，這樣既能保證研究數(shù)據(jù)的可靠性，又能節(jié)約能源和財(cái)力。

〔1〕張海峰，盧勝明，康峰，等.獨(dú)立通風(fēng)籠盒（IVC）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用〔J〕.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2011，28（6）：54-56.

〔2〕秦川.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

〔3〕任萍萍，程津津，史曉萍.屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施建設(shè)及運(yùn)行維護(hù)模式〔J〕.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2011，28（6）：57-58.

〔4〕柯賢福，周莎桑，樓琦，等.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)微生物動(dòng)態(tài)狀況〔J〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（3）：47-50.

〔5〕隋世燕，王林剛，賴仲輝，等.小鼠剖腹產(chǎn)凈化方法研究〔J〕.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，9（10）：46-49.

〔6〕張洪，鮑波.淺談國內(nèi)BALB/c小鼠及KM小鼠的基本生物學(xué)特性〔J〕.中國實(shí)用醫(yī)藥，2010，5（3）：252-254.

〔7〕林瑋，謝金東，劉德強(qiáng)，等.2種不同來源的飼料對(duì)小鼠生長和繁殖性能的影響〔J〕.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，20（4）：38-39.