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    巴洛沙星–Tb3+–ATP熒光體系的建立及其分析應(yīng)用

    2012-07-01 23:34:42富波陳傳燕王磊
    化學(xué)分析計(jì)量 2012年3期
    關(guān)鍵詞:巴洛沙星緩沖液

    富波,陳傳燕,王磊

    (1.山東大學(xué)藥學(xué)院,濟(jì)南 250012; 2.山東省高唐縣教育局,山東聊城 252000)

    巴洛沙星–Tb3+–ATP熒光體系的建立及其分析應(yīng)用

    富波1,陳傳燕2,王磊1

    (1.山東大學(xué)藥學(xué)院,濟(jì)南 250012; 2.山東省高唐縣教育局,山東聊城 252000)

    在二元配合物巴洛沙星–Tb3+中加入ATP,Tb3+在其特征波長545 nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),據(jù)此建立了新的巴洛沙星–Tb3+–ATP熒光體系。在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度與ATP的濃度呈良好的線性關(guān)系,線性范圍為2.0×10–6~3.0×10–5mol/L,檢出限為8.0×10–7mol/L。詳細(xì)的機(jī)理研究表明,ATP能與巴洛沙星–Tb3+形成大的三元絡(luò)合物熒光體系。新建立的熒光體系成功地應(yīng)用于ATP注射液中ATP的定量檢測。對不同批次ATP注射液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),回收率為101%~106%,測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%~1.9%(n=5)。

    ATP檢測;巴洛沙星;稀土鋱離子;喹諾酮類藥物

    三磷酸腺苷二鈉(ATP)是三磷酸腺苷的二鈉鹽,分子式為C10H14N5Na2O13P3·3H2O,相對分子質(zhì)量為605.19,化學(xué)名稱為腺嘌呤核苷-5'-三磷酸酯二鈉鹽三水合物。

    作為一種輔酶,ATP參與機(jī)體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖、核酸以及核苷酸的代謝,同時(shí)ATP又是體內(nèi)能量的主要來源,當(dāng)機(jī)體吸收、分泌、肌肉收縮及進(jìn)行生化合成反應(yīng)等需要能量時(shí),三磷酸腺苷即分解成二磷酸腺苷及磷酸基,同時(shí)釋放出能量。動(dòng)物試驗(yàn)證明,ATP可抑制慢反應(yīng)纖維的慢鈣離子內(nèi)流,阻滯或延緩房室結(jié)折返途徑中的前向傳導(dǎo),大劑量時(shí)還可能阻斷或延緩旁路的前向和逆向傳導(dǎo);另外ATP還具有短暫強(qiáng)的增強(qiáng)迷走神經(jīng)的作用,因而能夠治療房室結(jié)折返和旁路折返機(jī)制引起的心律失常。

    目前檢測ATP的方法主要有高效液相色譜方法[1,2],生物發(fā)光法[3–6]和熒光分析法[7–10]。高效液相色譜方法準(zhǔn)確度高,但是操作復(fù)雜而且靈敏度不高;生物發(fā)光法靈敏度較高,但是一般有復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng),不容易控制;相比之下,熒光分析法不僅操作簡便,而且通常靈敏度較高,適用于常規(guī)分析測試。

    目前已經(jīng)建立的測定ATP的熒光分析法主要有銪–四環(huán)素類–ATP[7]和鋱–喹喏酮類–ATP[8,9]熒光探針法和共振光散射方法[10]。

    巴洛沙星是第4代喹諾酮類抗菌藥,與其它喹諾酮類一樣,能夠與稀土鋱離子形成二元配合物,當(dāng)將ATP加入到該二元體系中時(shí),Tb3+在其特征波長545 nm處有明顯的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象,并且增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度與所加入的ATP的量之間呈良好的線性關(guān)系,據(jù)此建立了一種新的稀土發(fā)光方法來檢測ATP。該方法快速、簡單,而且線性范圍較寬,已經(jīng)成功地用于ATP注射液樣品中ATP含量的檢測。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與試劑

    熒光分光光度計(jì):F–4500型,日本日立公司;

    紫外分光光度計(jì):UV–2550型,日本島津公司;

    酸度計(jì):PHS–3C型,上海雷磁儀器廠;

    熒光分光光度計(jì):LS–55型,美國珀金–埃爾默公司;

    巴洛沙星(BLFX)對照品:99.0%,山東羅欣藥業(yè)股份有限公司;

    BLFX儲備液:1.0×10–3mol/L,精密稱取已干燥至恒重的巴洛沙星對照品0.038 9 g,滴入適量0.1 mol/L氫氧化鈉溶液使其溶解,定容至100 mL;

    鋱離子(Tb3+)儲備液:1.0×10–2mol/L,精密稱取七氧化四鋱(Tb4O7,光譜純,進(jìn)口分裝)0.187 1 g,滴加6 mol/L HCl適量,小心加熱使其溶解,待蒸發(fā)至近干,加水溶解并稀釋至100 mL,使用時(shí)逐級稀釋至刻度;

    三磷酸腺苷二鈉(ATP)貯備液:1.0×10–2mol/L,精密稱取三磷酸腺苷二鈉(98%)0.061 7 g,加水溶解并稀釋至100 mL,使用時(shí)逐級稀釋至刻度;

    Tris-HCl緩沖液:0.1 mol/L,精密稱取Tris 3.035 g,加水溶解并稀釋至250 mL,用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH 7.1;

    NH4Cl–NH3緩沖液:0.1 mol/L,精密稱取NH4Cl 0.54 g,加水溶解并稀釋至100 mL,用NH3·H2O調(diào)節(jié)至pH 7.1;

    NaAc–HAc緩沖液:0.1 mol/L,精密稱取NH4Cl 0.82 g,加水溶解并稀釋至100 mL,用HAc調(diào)節(jié)至pH 7.1;

    NH4Ac–NH3緩沖液:0.1 mol/L,精密稱取NH4Cl 0.77 g,加水溶解并稀釋至100 mL,用NH3·H2O調(diào)節(jié)至pH 7.1;

    所用試劑除標(biāo)明含量外均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水,儲備液置于4℃的冰箱中保存。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    于10 mL比色管中依次加入0.5 mL 0.1 mol/L Tris–HCl標(biāo)準(zhǔn)緩沖液,0.3 mL 1.0×10–4mol/L BLFX溶液,1.0 mL 1.0×10–3mol/L Tb3+溶液和不同體積1.0×10–4mol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作液,然后加蒸餾水稀釋并定容,振蕩搖勻,室溫下穩(wěn)定10 min后測其熒光光譜和吸收光譜,用1.0 cm熒光池,分別在λex=296 nm,λem=545 nm的條件下測定熒光強(qiáng)度,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

    在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,測定了該體系的激發(fā)和發(fā)射光譜,得到BLFX,ATP,BLFX–Tb3+,BLFX–ATP,Tb3+–ATP,BLFX–Tb3+–ATP的激發(fā)(1~6)和發(fā)射光譜(1’~6’)如圖1所示,IL代表熒光強(qiáng)度。

    圖1 激發(fā)和發(fā)射光譜

    從圖1中可以看出,單純的一元體系BLFX和BLFX–ATP二元體系的激發(fā)光譜相似,均在288 nm和334 nm處有一定的激發(fā);一元體系A(chǔ)TP、二元體系BLFX–Tb3+和Tb3+–ATP沒有較明顯的激發(fā)峰,而三元體系BLFX–Tb3+–ATP分別在波長296 nm和335 nm有兩個(gè)明顯的激發(fā)峰。單純的BLFX在約450 nm處有一個(gè)很強(qiáng)的發(fā)射峰(圖中未完全顯示),BLFX–ATP也在約450 nm處有一個(gè)很強(qiáng)的發(fā)射峰,說明450 nm為BLFX的特征發(fā)射峰。BLFX–Tb3+二元體系在BLFX特征峰450 nm處的熒光明顯減弱,然而在Tb3+的特征發(fā)光波長545 nm處仍無明顯發(fā)光,當(dāng)加入ATP于此二元體系形成BLFX–Tb3+–ATP三元體系時(shí),發(fā)現(xiàn)在鋱離子的特征發(fā)射波長489 nm和545 nm較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,證明三元體系的形成有利于配體之間的能量轉(zhuǎn)移,使熒光量子產(chǎn)率大大提高。

    分別以波長296 nm和335 nm為激發(fā)波長,測定了其發(fā)射光譜,結(jié)果表明當(dāng)激發(fā)波長為296 nm時(shí),三元體系BLFX–Tb3+–ATP在鋱離子的特征發(fā)射波長為489 nm和545 nm時(shí)有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,當(dāng)激發(fā)波長為335 nm時(shí),三元體系BLFX–Tb3+–ATP在鋱離子的特征發(fā)射波長489,545,583 nm處均有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。在鋱離子的特征發(fā)光波長545 nm處的強(qiáng)度以296 nm為激發(fā)波長時(shí)較強(qiáng),因此選擇λex=296 nm,λem=545 nm進(jìn)行進(jìn)一步研究測定。

    實(shí)驗(yàn)條件:BLFX,3.0×10–6mol/L;Tb3+,1.0×10–4mol/L;ATP,3.0×10–5mol/L;Tris-HCl,5.0×10–3mol/L,pH 7.1。

    2.2 pH值和緩沖溶液的影響

    實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了pH值的變化對體系熒光強(qiáng)度增強(qiáng)ΔIL(ΔIL=I–I0)的影響,其中I為BLFX–Tb3+–ATP的熒光強(qiáng)度,I0為BLFX–Tb3+體系即不加待測ATP的空白的熒光強(qiáng)度。同樣,以下其它條件均指對ΔIL的影響。pH值的影響如圖2所示,由圖2可知,當(dāng)pH 7.1時(shí),熒光強(qiáng)度ΔIL達(dá)到最大。同時(shí)實(shí)驗(yàn)了pH 7.1的不同緩沖液的影響,包括Tris-HCl,NH4Cl–NH3,NaAc–HAc和NH4Ac–NH3等,結(jié)果如表1所示,發(fā)現(xiàn)Tris-HCl緩沖液的緩沖效果最好,實(shí)驗(yàn)中選擇用0.5 mL 0.1 mol/L Tris–HCl緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步研究。

    圖2 pH的影響

    表1 不同緩沖溶液對體系熒光強(qiáng)度的影響

    2.3 巴洛沙星濃度的影響

    在其它物質(zhì)濃度均為最佳條件下,實(shí)驗(yàn)了不同濃度的巴洛沙星(1.0×10–6~7.5×10–6mol/L)對體系熒光強(qiáng)度的影響,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)巴洛沙星的濃度在2.5×10–6~3.5×10–6mol/L范圍時(shí)體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)達(dá)到最大,因此實(shí)驗(yàn)中選擇最佳濃度3.0×10–6mol/L進(jìn)行研究。

    2.4 鋱離子濃度的影響

    使體系中其它物質(zhì)濃度都在最佳條件下且保持固定,實(shí)驗(yàn)了不同濃度鋱離子對該體系的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)鋱離子濃度為1.0×10–4mol/L時(shí),體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)達(dá)到最大且保持恒定,于是選擇1.0×10–4mol/L為最佳濃度進(jìn)行研究。

    2.5 試劑的加入順序和信號穩(wěn)定性

    在所有物質(zhì)濃度均為最佳條件下,實(shí)驗(yàn)了不同加樣順序?qū)w系熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的加樣順序下體系的熒光強(qiáng)度差別不大,重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)加樣順序?yàn)锽LFX,Tb3+,ATP,Tris–HCl時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。因此選擇此加樣順序進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)了不同穩(wěn)定時(shí)間對熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)穩(wěn)定10 min時(shí)熒光強(qiáng)度即可達(dá)到最大,繼續(xù)增加穩(wěn)定時(shí)間熒光強(qiáng)度變化不大,信號強(qiáng)度在2 h內(nèi)保持不變。

    表2 試劑加入順序的影響

    2.6 干擾物質(zhì)的影響

    固定ATP濃度為1.0×10–5mol/L,其它物質(zhì)濃度均在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,實(shí)驗(yàn)了一些共存物質(zhì)的影響,結(jié)果如表3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對誤差在±10%以內(nèi)時(shí),大多數(shù)氨基酸和金屬離子對體系熒光強(qiáng)度影響不大。

    表3 共存干擾物質(zhì)的影響

    2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

    在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,該體系的熒光強(qiáng)度ΔIL與ATP的濃度c呈良好的線性關(guān)系,線性范圍為2.0×10–6~3.0×10–5mol/L。線性方程為ΔIL=–161.4+9.391×107cATP,相關(guān)系數(shù)為0.998 1。在信噪比為3時(shí),檢出限為8.0×10–7mol/L。

    2.8 樣品分析

    取市售ATP注射液針劑(江蘇康寶制藥有限公司,批號080753,080105,080454;天津藥業(yè)焦作有限公司,批號08072231),從針劑中精確量取1.0 mL于100 mL容量瓶中,加水稀釋并定容至刻度,得到濃度為1.65×10–4mol/L的儲備液,使用時(shí)將其稀釋到一定程度即得工作液。

    在10 mL比色管中,依次加入0.3 mL 1.0×10–4mol/L BLFX溶液,1.0 mL的1.0×10–3mol/L Tb3+溶液和0.6 mL 1.65×10–4mol/L的ATP注射劑工作液,0.5 mL 0.1 mol/L Tris–HCl標(biāo)準(zhǔn)緩沖液,按照實(shí)驗(yàn)方法所述進(jìn)行測定,測定結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示該方法測得的含量與標(biāo)簽上的值在允許誤差范圍內(nèi)能較好地符合。

    表4 ATP注射液測定結(jié)果(n=5)

    2.9 機(jī)理探討

    2.9.1 BLFX–Tb3+–ATP三元復(fù)合物的形成

    BLFX,ATP,BLFX–Tb3+,BLFX–ATP,Tb3+–ATP和BLFX–Tb3+–ATP的吸收光譜如圖3所示。

    圖3 紫外吸收光譜

    從圖3中可以看出,單純的BLFX在波長286 nm有一較強(qiáng)的吸收峰,在334 nm處有一個(gè)較弱但較平穩(wěn)的吸收峰;BLFX–Tb3+與BLFX的吸收峰峰形相似,最大吸收波長略有紅移,分別在290 nm和336 nm處有兩個(gè)吸收鋒,且強(qiáng)度比BLFX有一定的增大,這說明BLFX和Tb3+存在相互作用,形成了配合物。單純的ATP僅在波長260 nm處有一個(gè)很強(qiáng)的吸收峰,在波長大于288 nm后無明顯吸收,說明ATP在260 nm處有特征吸收;BLFX–ATP除在259 nm處有一個(gè)很強(qiáng)的吸收峰,且強(qiáng)度大于單純的ATP外,在波長大于288 nm后約331 nm處有一較寬的吸收帶,但強(qiáng)度很弱;Tb3+–ATP在260 nm處有一個(gè)吸收峰,強(qiáng)度比單純的ATP稍低;三元體系BLFX–Tb3+–ATP不僅在ATP的特征吸收峰259 nm處有一吸收峰,而且在290 nm處出現(xiàn)了一肩峰,在334 nm處出現(xiàn)一較平穩(wěn)峰,證明三者之間相互作用,又生成了新的BLFX–Tb3+–ATP大分子三元復(fù)合物。

    通過共振光散射光譜(RLS)進(jìn)行證明。按照實(shí)驗(yàn)最佳條件配制溶液并穩(wěn)定30 min后,用1.0 cm熒光池,通過同時(shí)掃描,使激發(fā)和發(fā)射波長相等,狹縫λex=10 nm/λem=10 nm,測定RLS光譜,共振光散射光譜如圖4所示。從圖4中可以看出,單純的一元體系BLFX的共振光散射很弱,單純的ATP的共振光散射較強(qiáng),二元體系BLFX–Tb3+,BLFX–ATP,Tb3+–ATP的共振光散射強(qiáng)度沒有明顯增強(qiáng),而三元體系BLFX–Tb3+–ATP的共振光散射有明顯的增強(qiáng)。證明了ATP與BLFX–Tb3+之間有強(qiáng)烈的相互作用,形成了一個(gè)大的超分子復(fù)合物。

    圖4 共振光散射光譜

    2.9.2 發(fā)光增強(qiáng)機(jī)制

    喹喏酮類藥物BLFX是稀土鋱離子的良好配體,二者之間通過共振能量轉(zhuǎn)移,BLFX能將其能量轉(zhuǎn)移給稀土鋱離子,從而使鋱離子發(fā)出其特征熒光。加入ATP后,體系中發(fā)光明顯增強(qiáng)。通過以上實(shí)驗(yàn)可知,BLFX和Tb3+的最佳條件下濃度比值為1∶33.3,即在該體系中Tb3+大大過量,則Tb3+除了與BLFX形成配合物外,還會和周圍的水分子結(jié)合,這樣就會因?yàn)樗肿又蠴—H的震動(dòng)而引起非輻射能量損耗。而加入ATP后,ATP中的三磷酸根負(fù)離子會與過量的鋱離子結(jié)合,從而取代了鋱離子周圍的水分子,形成了大的三元復(fù)合物BLFX–Tb3+–ATP,既減少了因水分子的O—H的震動(dòng)而引起的非輻射能量損耗,又增加了體系的疏水性,所以體系中鋱離子的熒光明顯增強(qiáng)。

    3 結(jié)論

    在二元配合物BLFX–Tb3+中加入ATP,ATP能顯著增強(qiáng)該體系中鋱離子的特征發(fā)光,據(jù)此建立了一個(gè)新的BLFX–Tb3+–ATP熒光探針體系。詳細(xì)的機(jī)理研究表明ATP能與BLFX–Tb3+形成大的三元絡(luò)合物熒光體系。新建立的熒光探針體系成功地應(yīng)用于ATP注射液中ATP的定量檢測,為常規(guī)檢測ATP提供了一個(gè)簡便靈敏的方法。

    [1] 郝蘇麗,徐康森.高效液相色譜法測定三磷酸腺苷二鈉含量[J].中國生化藥物雜志,2001,22(6): 305–306.

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    Establishment of Balo fl oxacin-Tb3+–ATP Fluorescence System and Its Analytical Application

    Fu Bo1, Chen Chuanyan2, Wang Lei1
    (1.School of Pharmacy, Shandong University, Jinan 250012, China;2.Gaotang Education Bureau, Shandong Province, Liaocheng 252000, China)

    A new balo fl oxacin-Tb3+–ATP fl uorescence system was established. Adding ATP into the binary system of balo fl oxacin-Tb3+,the fl uorescence intensity of Tb3+increased in its characteristic wavelength of 545 nm. Under the optimal experimental conditions,the enhanced fl uorescence intensity was proportional to the concentration of ATP in the range of 2.0×10–6–3.0×10–5mol/L,the detection limit was 8.0×10–7mol/L. The detailed mechanistic studies showed that ATP could form a ternary complex with balo fl oxacin-Tb3+. This new fl uorescence system was successfully applied to the quantitative detection of ATP in injection. The recoveries of ATP injecta were 101%–106%, the RSD was 1.1%–1.9%(n=5).

    ATP detection; balo fl oxacin; terbium ion; quinolones

    O657.39

    A

    1008–6145(2012)03–0039–05

    10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.011

    聯(lián)系人:王磊;E-mail: wangl-sdu@sdu.edu.cn

    2012–02–09

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