超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定銀杏葉中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

劉雪，盧蕾，馬金鳳，李亮亮，李麗霞，趙志強，許志強，吳成，王明林

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018； 2.山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護總站，濟南 250100）

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定銀杏葉中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

劉雪1，盧蕾1，馬金鳳1，李亮亮1，李麗霞2，趙志強2，許志強2，吳成2，王明林1

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018； 2.山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護總站，濟南 250100）

建立了銀杏葉中15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。樣品經(jīng)乙腈提取，TPT固相萃取柱凈化，通過XTerra MS C18色譜柱分離，供串聯(lián)質(zhì)譜測定。15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥在0.02～0.5 mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.996 2～0.999 9；在0.004，0.01，0.02，0.04 mg/kg 4個添加水平下，其平均回收率為65.22%～96.66%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.43%～10.06%（n=5）。該方法凈化效果好、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可滿足銀杏葉中15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的檢驗要求。

液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法；氨基甲酸酯類；農(nóng)藥殘留；銀杏葉

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是繼有機氯、有機磷類農(nóng)藥后發(fā)展較為迅速的一類高效、廣譜殺蟲劑，具有殺蟲效果顯著、分解快、代謝迅速、殘留期短等特點［1，2］，此外還常被作為殺菌劑、除草劑和生長調(diào)節(jié)劑。由于部分有機氯農(nóng)藥的限制使用以及抗藥性昆蟲品種的增加，氨基甲酸酯類農(nóng)藥使用量逐年增加，其在作物上的殘留對人體健康的危害以及對環(huán)境的破壞越來越受到人們的關(guān)注。

目前，對氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析方法主要有HPLC，GC–MS，HPLC–MS等［3–11］。由于該類化合物極性強，熱穩(wěn)定性較差，有些物質(zhì)在氣相色譜分析的溫度下發(fā)生分解，用GC或GC–MS分析不理想；液相色譜熒光檢測法需要經(jīng)過衍生化才能進行測定，操作繁瑣，分析時間長，消耗的溶劑量較大；超高壓液相色譜配以串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有分析效率高、分析時間短、靈敏度高的特點，能夠滿足進出口對氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測要求。

銀杏葉提取物對預(yù)防和治療心腦血管等疾病有顯著效果，并具有抗癡呆及延緩衰老的功能。在銀杏種植過程中，為防治昆蟲的侵害，人們大量使用農(nóng)藥，從而引起農(nóng)藥殘留問題。隨著國外技術(shù)壁壘的提高，歐盟和美國，尤其是日本肯定列表制度實施后，對銀杏葉出口農(nóng)藥殘留檢測要求更高，大大制約了我國銀杏葉的出口。為了克服國外技術(shù)壁壘，筆者利用固相萃取技術(shù)，結(jié)合液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法建立了銀杏葉中15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析方法。結(jié)果表明，該方法簡便、靈敏高、凈化效果好，可滿足銀杏葉中常用的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的檢驗需要。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜：ACQUITY Ultra PerformanceLC型，美國Waters公司；

質(zhì)譜儀：Micromass Quattro Ultima IMPT型，美國Waters公司；

高速勻漿機：T–25 basic型，德國IKA公司；

高速離心機：3K30型，美國Sigma公司）；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Laborota 4000型，美國Heidolph公司；

氮吹儀：N–EVAP 112型，美國Organomation公司；

固相萃取柱：TPT，2 000 mg/（12 mL）；

乙腈、甲苯：分析純；

甲醇：色譜純；

乙酸銨：優(yōu)級純；

實驗用水為新制備的二次蒸餾水；

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：吸取適量的15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇稀釋成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，保存于0～4℃冰箱中；

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取適量15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇稀釋成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0～4℃冰箱保存。

1.2 儀器條件

色譜條件 XTerra MS C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫：40℃；進樣量：5 μL；梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件 電噴霧離子源ESI（+）；多重反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM）；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：400℃；脫溶劑氣流量：500 L/h；錐孔氣流量：80 L/h；定性離子、定量離子、錐孔電壓和碰撞能量見表2。

1.3 實驗方法

稱取樣品5.0 g于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，均質(zhì)1 min，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液完全轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，濾渣再用10 mL乙腈均質(zhì)提取一次，離心后合并上清液于同一50 mL離心管中，置于–20℃冰箱中冷凍2 h，取出后迅速以4 000 r/min冷凍離心3 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于40℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1～2 mL，待凈化。

表2 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的質(zhì)譜條件

將濃縮液轉(zhuǎn)移入用10 mL乙腈–甲苯（體積比為3∶1）活化的TPT柱（柱前加2 cm無水硫酸鈉），當(dāng)濃縮液液面達到固定相頂端時，用25 mL乙腈–甲苯（體積比為3∶1）混合溶液洗脫被測物，收集全部洗脫液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，并濃縮至近干，氮氣吹干。用1.0 mL乙腈溶解，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

考察了乙腈、乙腈–甲苯（體積比為3∶1）、丙酮–正己烷（體積比為1∶4）、乙酸乙酯–正己烷（體積比為1∶1）4種常見提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，丙酮–正己烷、乙酸乙酯–正己烷去油效果差，與正己烷溶解部分油脂有關(guān)；乙腈和乙腈–甲苯相比較，乙腈提取的回收率更高，所以選用乙腈為提取液。

對比了提取溶劑用量分別為10，20，30，40 mL時對提取效果的影響。發(fā)現(xiàn)提取溶劑用量為30 mL時提取效果最佳，40 mL時溶出的樣品雜質(zhì)、油脂較多。因此實驗選擇30 mL乙腈為提取溶劑。

離心后的樣品出現(xiàn)油狀物質(zhì)，嚴(yán)重干擾了被測物。為不影響后續(xù)實驗，選用凈化前加正己烷、凈化后加正己烷以及冷凍除脂的方法，去除油狀物質(zhì)。結(jié)果表明，正己烷除脂效果差，且部分被測物溶于正己烷而降低回收率。采用均質(zhì)后冷凍2 h再冷凍離心的效果最好，能滿足試驗要求。

2.2 樣品凈化條件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

對于極性較大的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析，采用液–液分配法凈化后，回收率往往很低，具有很大的局限性，目前較多采用固相萃取技術(shù)進行凈化。通過查閱相關(guān)文獻，選取C18柱、NH2柱、PSA柱、石墨化炭黑/氨基柱、TPT柱進行對比試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C18柱、NH2柱去除色素效果較差，凈化后色素較深；PSA柱和石墨化炭黑/氨基柱雖能去除大部分色素，但回收率遠不如TPT柱；經(jīng)TPT柱凈化后的收集液呈透明狀，且回收率符合要求。因此實驗選用TPT柱凈化。

2.2.2 洗脫液及其用量的選擇

分別考察了乙腈、乙腈–甲苯（體積比為3∶1）、丙酮–正己烷（體積比為1∶4）、乙酸乙酯–正己烷（體積比為1∶1）各25 mL時的洗脫效率。結(jié)果表明，乙腈–甲苯混合溶液作為洗脫液時，測得的各農(nóng)藥的回收率優(yōu)于其它3種洗脫液。因此選用乙腈–甲苯混合溶液作為洗脫液。

分別采用10，20，25，30 mL洗脫液洗脫，考察15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥回收率。結(jié)果表明，洗脫液超過25 mL時，部分農(nóng)藥回收率過高，說明過量的洗脫液將部分雜質(zhì)洗脫下來，影響了農(nóng)藥的檢測。因此確定洗脫液體積為25 mL。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 流動相的選擇

實驗采用了不同配比的乙腈–甲酸水（0.1%）、甲醇–甲酸水（0.1%）、乙腈–乙酸銨（1 mmol/L）、甲醇–乙酸銨（1 mmol/L）作流動相，當(dāng)有機相為乙腈時，由于乙腈的洗脫能力更強，分析物無法得到充分的分離，所以有機相選擇甲醇。甲醇–乙酸銨（1 mmol/L）比甲醇–甲酸水（0.1%）洗脫的分析物響應(yīng)值高，靈敏度更好，故實驗選擇了甲醇–乙酸銨（1 mmol/L）作為流動相。實驗比較了不同的梯度程序，殘殺威和克百威（保留時間分別為6.20 min和6.26 min）、硫雙威和抗蚜威（保留時間分別為6.96 min和7.09 min）未能得到有效分離，但采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）可避免相互干擾，不影響測定結(jié)果。

2.3.2 質(zhì)譜條件的選擇

采用1.0 mg/L氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動注射的方式在正離子模式下進行母離子全掃描，調(diào)節(jié)電離電壓和錐孔電壓，確定各氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分子離子，然后對其子離子進行全掃描，優(yōu)化子離子及碰撞能量，確定其中選擇性最強的兩個子離子作為監(jiān)測離子。圖1為15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥（質(zhì)量濃度均為0.2 mg/L）的總離子流色譜圖。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品MRM總離子流色譜圖

2.4 線性方程

以空白基質(zhì)配制0.02，0.05，0.1，0.2，0.5 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進行測定，以進樣濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進行線性回歸，線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥線性方程、LOD和LOQ

2.5 方法的回收率和精密度

在銀杏空白樣品中分別添加混合標(biāo)準(zhǔn)品0.004，0.01，0.02，0.04 mg/kg 4個水平，每個水平重復(fù)測定5次，測定結(jié)果見表4。銀杏葉4個添加濃度平均回收率硫雙威為65.22%～72.74%，其它為76.18%～96.66%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.43%～10.06%，表明該方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥在銀杏葉中的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）見表3。

實驗中除了硫雙威外的分析物回收率都在農(nóng)殘分析要求范圍內(nèi)，硫雙威回收率低可能由于在凈化過程中與TPT柱內(nèi)的填料產(chǎn)生較強的吸附，洗脫液很難將其洗脫下來。

表4 各濃度添加回收率

續(xù)表4

2.6 實際樣品測定

用所建立的方法對從基地上購買的銀杏葉進行處理和實際測定，所測樣品中15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥組分均未檢出。

3 結(jié)論

建立了銀杏葉中15種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜檢測法，獲得了滿意的分離效果和檢測靈敏度，方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性好、靈敏度高，能滿足銀杏葉出口檢測需要，符合殘留分析質(zhì)量控制指南的要求。

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Determination of Carbamate Pesticides Residue in Ginkgo Leaves by UPLC–MS–MS

Liu xue1， Lu Lei1， Ma Jinfeng1， Li Liangliang1， Li Lixia2， Zhao Zhiqiang2, Xu Zhiqiang2， Wu Cheng2， Wang Minglin1
(1. College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Tai’an 271018， China； 2. Agro-environment Protection Station of Shandong Province， Jinan 250100， China)

15 carbamate pesticides residue in ginkgo leaves were determined by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC–MS–MS). The sample was extracted with acetonitrile，which was concentrated and puri fi ed by TPT solid-phase extraction column. The eluate was separated on XTerra MS C18column，and used for tandem MS analysis. The recoveries of the 15 carbamate pesticides in ginkgo leaves (from 0.004 to 0.04 mg/kg) ranged from 65.22% to 96.66% with the relative standard deviations of 1.43%–10.06%(n=5). The linear correlation coef fi cient was 0.996 2–0.999 9. The method has good puri fi cation effect, reproducibility and high sensitive. It can meet the requirements for the simultaneous determination of 15 carbamate pesticides residue in ginkgo leaves.

UPLC–MS–MS; carbamate; pesticide residue; ginkgo leaf

O657.63

A

1008–6145(2012)03–0060–05

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.016

聯(lián)系人：王明林；E-mail: mlwang@sdau.edu.cn

2012–03–15