羊口瘡病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

姚 俊，李富祥，彭海生，魯富有，張喬明，李華春＊

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224；2.云南省普洱市動物疫病預防控制中心，云南 普洱 665000）

羊口瘡（Orf）也叫羊接觸傳染性膿皰性皮炎（Sheep contagious pustular dermatitis），是由羊口瘡病毒（Orf virus）引起的綿羊和山羊的一種接觸傳染性、嗜上皮性傳染病[1]。本病特征是在口唇、眼、乳房、鼻孔周圍的皮膚上出現(xiàn)丘疹和水皰，并迅速變?yōu)槟摪挘詈笮纬绅杵せ蝠酄畈∽儭ｉ铕韫竅1]。羊口瘡的發(fā)病率為30%～50%，死亡率差異較大，在飼養(yǎng)衛(wèi)生條件不良的羊群中，羔羊的死亡率可高達20%[1]。人在接觸病羊時，?？砂l(fā)生感染。病變大多發(fā)生于手、腕或臉。先是丘疹，隨后變?yōu)樗捇蚰摪挘車つw紅腫，局部疼痛，淋巴結腫大，最后結痂自愈[1]。2005年8月福建省永安市有8名羊場養(yǎng)殖工人因感染羊傳染性膿皰病毒而發(fā)病[2]。因此，羊傳染性膿皰不但嚴重危害肉羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，而且威脅人類的身體健康，是一種危害較為嚴重的人畜共患傳染病[3]。

本病最早于1920年發(fā)現(xiàn)于歐洲，現(xiàn)已廣泛分布于世界各地，我國新疆、甘肅、青海、內蒙以及東北三省的主要養(yǎng)羊地區(qū)均有本病發(fā)生的報道[1，4]。2010年底至2011年初云南省普洱市放牧山羊暴發(fā)、流行羊口瘡。2011年12月保山市放牧山羊也出現(xiàn)羊口瘡的發(fā)生與流行。

由于本病發(fā)病羊只在口唇、眼、鼻、乳房、肛門、外陰等部位出現(xiàn)與山羊痘相似的丘疹結節(jié)，在臨床上沒有經(jīng)驗的獸醫(yī)人員僅憑臨床觀察很難對本病做出確診，因此，有必要建立一種靈敏、特異、快速、安全、可靠的病原檢測方法。目前國內建立了羊口瘡病原的PCR檢測方法[5]，羊痘病毒和羊口瘡病毒二重 PCR鑒別檢測方法[6－7]，羊傳染性膿皰病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法[8]。傳統(tǒng)PCR檢測方法耗時、費力、容易污染、容易出現(xiàn)假陽性，電泳過程中所使用的核酸染料溴化乙錠（EB），對環(huán)境及檢測人員具有較大危害性。國內報道的羊傳染性膿皰病毒SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法靈敏度太低，僅能檢測到為9.4×104copies／μL，特異性試驗僅僅檢測了綿羊痘病毒（SPV），擴增采用3步法，檢測時間較長，耗時2h[8]。國外有為數(shù)不多的羊口瘡病毒SYBR GreenⅠ和TaqMan real－time PCR的建立及應用報道[9－11]。國內至今未見羊口瘡病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法建立及應用的報道。研究建立的羊口瘡病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測靈敏度達1×101copies／μL，上機檢測時間不超過40min，羊痘及禽痘病毒檢測均為陰性，組內及組間重復試驗變異系數(shù)均低于2%，更適合于羊口瘡臨床樣品的早期檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及毒株 2份送檢的可疑羊口瘡口唇組織病料，1份采集自云南普洱市，1份采集自云南保山市；羊口瘡病毒牛睪丸細胞適應毒株，作為陽性對照使用，山羊痘病毒XW毒株牛睪丸細胞適應毒、禽痘病毒疫苗毒株，均為云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室保存。

1.1.2 引物及探針 根據(jù)GenBank公布的羊口瘡病毒基因組（AY386264）中ORFVgORF121和ORFVgORF122基因DNA序列，應用Beacon Designer 7.7軟件，設計出一對TaqMan實時熒光定量PCR引物和一條探針：

Taq－ORFVgORF121－122－F：5′－TCTATCGTC GCTACATAC－3′；

Taq－ORFVgORF121－122－R：5′－GCTTCTTAT TTCACATTACAG－3′；

ORF121－122－probe：FAM－5′－CTAAGACACT ACTCGCCACGC－3′－BHQ1。

探針5′端的報告熒光為FAM，3′端的淬滅基團為BHQ1，擴增片段位于基因組DNA序列第121834bp～122032bp處，擴增片段長度為199 bp，最適合退火溫度為（Ta opt）59.9℃。

1.1.3 主要試劑及儀器 小量病毒柱式DNA抽提試劑盒為上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit）及2×Taq PCR Master Mix為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；2×Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）、50× ROX Dye Ⅱ、PMD18TSimple連接試劑盒及DH5α受體菌為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。紫外分光光度計（Nanovue plus）為美國 GE公司生產(chǎn)；PCR儀為ABI（applied biosystems Inc.）公司生產(chǎn)的Gene Amp PCR System 9700；定量PCR儀為ABI（applied biosystems Inc.）公司生產(chǎn)的7500Fast PCR System。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提 將送檢組織病料勻漿后3500 r／min離心5min，取上清液按小量病毒柱式DNA抽提試劑盒說明書抽提病毒DNA，將羊口瘡病毒牛睪丸細胞培養(yǎng)物及禽痘病毒弱毒活疫苗按同樣方法抽提病毒DNA。

1.2.2 pMD18T克隆質粒的構建及質粒標準品的制備 以提取的羊口瘡病毒（ORFV）牛睪丸細胞適應毒株DNA為模板，以本文設計的TaqMan實時熒光定量PCR引物作為擴增引物，進行PCR擴增。采用50μL反應體系，95℃10min；95℃20s，55℃30s，72℃35s，35個循環(huán)；最后72℃5min。對PCR產(chǎn)物進行切膠回收，16℃30min連接PMD18T質粒，連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，轉化細菌經(jīng)37℃振蕩培養(yǎng)復蘇后，涂抹于含有Amp的LB平板，進行陽性克隆篩選。隨機挑取5個白色菌落進行PCR擴增鑒定，鑒定出的陽性克隆經(jīng)增菌培養(yǎng)后，抽提重組質粒送寶生物工程（大連）有限公司測序，測序結果與GenBank序列比對無誤后，應用紫外分光光度計測定出重組質粒的濃度（ng／μL），根據(jù)重組質粒的分子質量與質量濃度，計算其拷貝數(shù)濃度，在－80℃ 保存?zhèn)溆?。計算公式為：拷貝濃度（copies／μL）＝ （6.02×1023）×（重組質粒濃度ng／μL×10－9）／（660×堿基數(shù)）。

1.2.3 TaqMan real－time PCR 的建立、最佳引物、探針濃度篩選 根據(jù)所采用Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）預混液中酶的特性，以及擴增目的DNA片斷的最佳退火溫度，確定反應條件為95℃30s，95℃5s、60℃30s，根據(jù)試驗目的可進行35個～60個循環(huán)。

最佳引物濃度篩選：20μL反應體系：2×Premix Ex TaqTM （Probe qPCR）10μL，50×ROX DyeⅡ0.4μL，1×107copies／μL重組質粒1μL作為模板，10μmol／L的探針0.8μL（終濃度為400 nmol／L），選擇10μmol／L 上下游引物各1.2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μL（對應的終濃度分別為600、500、400、300、200、100、50nmol／L），添加 PCR級無離子水補足20μL后進行qPCR擴增，95℃30s，95℃5s、60℃30s擴增45次循環(huán)。

1.2.3.1 最佳探針濃度篩選 20μL反應體系：2× Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10μL，50×ROX DyeⅡ0.4μL，1×107copies／μL重組質粒1μL作為模板，10μmol／L上下游引物各0.4μL，選擇10μmol／L探針各1.2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 μL（對應的終濃度分別為600、500、400、300、200、100、50nmol／L），添加PCR級無離子水補足20μL后進行qPCR擴增，95℃30s，95℃5s、60℃30 s，擴增45次循環(huán)。

1.2.3.2 TaqMan real－time PCR 的 建 立 20μL反應體系：2× Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）10 μL，50×ROX DyeⅡ0.4μL，保山及普洱臨床組織樣品抽提DNA各1μL為模板，10μmol／L上下游引物各0.4μL（終濃度200nmol／L），10μmol／L探針0.6μL（終濃度300nmol／L），添加PCR級無離子水補足20μL后，95℃30s，95℃5s、60℃30s擴增45次循環(huán)，同時設立陰陽性對照。

1.2.4 TaqMan real－time PCR的重復性檢測 選擇同一模板不同稀釋度進行4個重復和4個不同模板樣品進行4個重復，檢驗本試驗建立的羊口瘡TaqMan real－time PCR的組內重復及組間重復的穩(wěn)定性。方法參照1.2.3。

1.2.5 TaqMan real－time PCR 特 異性試 驗 以1.2.1中抽提的山羊痘牛睪丸細胞適應毒XW毒株、禽痘病毒疫苗毒株DNA作為特異性檢測模板。以羊口瘡病毒（ORFV）標準毒株抽提DNA作陽性對照，PCR級超純水作為陰性對照，進行TaqMan real－time PCR特異性試驗。方法參照1.2.3。

1.2.6 TaqMan real－time PCR靈敏度試驗 選擇1×104copies／μL至1×100copies／μL PMD18T重組質粒作為模板進行qPCR擴增，以測定所建立的TaqMan real－time PCR方法的最低檢測極限模板量。方法參照1.2.3。

1.2.7 羊口瘡臨床組織病料定量檢測 將重組質粒10倍梯度系列稀釋，選取1×108copies／μL至1×105copies／μL共4個稀釋度的質粒作為標準品，建立以質?？截悢?shù)為單位的絕對定量標準曲線來對云南保山、普洱送檢羊口瘡（Orf）臨床組織病料進行定量檢測，同時設立陰陽性對照。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

PCR擴增出長度約199bp的目的片段，見圖1。

圖1 目的DNA片段的PCR擴增結果Fig.1 PCR results of target DNA fragment

2.2 陽性克隆PCR鑒定結果

據(jù)圖2顯示，隨機挑選的1～5號菌落均擴增出預期長度的DNA片段，3號菌落擴增出單一、明亮的DNA片段，而1、2、4、5號菌落擴增出的目的片段較模糊。挑取3號菌落接種于含有Amp的LB培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)過夜，抽提質粒測序，測序結果顯示插入片段DNA序列與目的片段序列完全吻合。

圖2 陽性克隆PCR鑒定結果Fig.2 Identification of positive colonies by PCR

2.3 最佳引物、探針濃度篩選結果

200nmol／L～500nmol／L引物濃度范圍擴增出的S型曲線線形均勻、一致，濃度較低的且峰線靠右側的200nmol／L可作為最佳引物濃度（圖3）。

圖3 最佳引物濃度篩選擴增圖Fig.3 The amplification plot of screening for the optimal primer concentration

200、300、500、600nmol／L 的探針濃度擴增出的S型曲線線形均勻一致，200nmol／L～300 nmol／L的濃度范圍可作為最佳探針濃度（圖4）。

2.4 TaqMan real－time PCR檢測方法擴增圖

保山、普洱送檢樣品及陽性對照均擴增出S形曲線，陰性對照未擴增出S形曲線（圖5）。當域值為0.02時，BS、PE和陽性對照的 Ct值分別為20.4336、23.6446、27.5835。

圖4 最佳探針濃度篩選擴增圖Fig.4 The amplification plot of screening for the optimal probe concentration

2.5 穩(wěn)定性試驗結果

組內重復試驗和組間重復試驗變異系數(shù)均低于2%，說明試驗穩(wěn)定，重復性好，結果見表1、表2。

2.6 特異性試驗結果

除了羊口瘡病毒DNA模板擴增出S形曲線外，羊痘及禽痘病毒DNA模板均未能擴增出S形曲線（圖6）。

2.7 靈敏度檢測結果

圖5 羊口瘡臨床組織樣品TaqMan real－time PCR擴增圖Fig.5 The amplification plot of the clinical samples of orf and positive control by TaqMan real－time PCR

1×104copies／μL至1×101copies／μL稀釋度的重組質粒均擴增出了S形曲線，而1×100copies／μL稀釋度的重組質粒和陰性對照未擴增出任何峰線，結果顯示所建立方法的檢測最低極限為1×101個病毒拷貝（圖7），圖中S型曲線由左到右分別由1×104～1×101拷貝重組質粒作為模板擴增而得。

表1 同一樣品不同濃度的組內重復試驗結果（Ct值）Table1 The experimental data of four replicates of the same sample at different concentrations

表2 不同樣品的組間重復試驗結果（Ct值）Table2 The inter－assay experimental data of four replicates of different samples

圖6 TaqMan real－time PCR特異性試驗結果Fig.6 The amplification figure for specific test of TaqMan real－time PCR

圖7 靈敏度試驗擴增圖Fig.7 The amplification plot of Taq Man real－time PCR for the sensitivity

2.8 云南保山、普洱送檢羊口瘡臨床組織樣品定量檢測結果

1×108copies／μL至1×105copies／μL共4個稀釋度的重組質粒及陽性對照均擴增出S形曲線，保山市及普洱市送檢的羊口瘡（Orf）臨床組織樣品均擴增出S型曲線（圖8）。其抽提的DNA洗脫液

圖8 羊口瘡臨床組織樣品TaqMan法實時熒光定量PCR擴增圖Fig.8 The amplification figure of the clinical samples of orf by TaqMan real－time fluorescence quantitative PCR

3 討論

作為診斷及疫病防控目的，實時熒光定量PCR通常被運用來對臨床樣品進行病毒定量檢測。截止到目前，國內未見有羊口瘡病毒TaqMan real－time PCR檢測方法的建立與運用報道。本文就針對羊口瘡病毒建立了一種靈敏、特異、穩(wěn)定、安全、快速的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法，并運用于臨床組織樣品的定量檢測。文中real－time PCR采用的TaqMan探針是特異性結合于靶序列，在進行延伸反應時，聚合酶的5′外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離進而發(fā)出熒光，而熒光染料SYBR Green I是非特異性嵌合于PCR產(chǎn)物的DNA雙鏈時發(fā)出熒光，因而容易造成假陽性及導致熒光信號本底高。TaqMan探針法實時熒光定量PCR與傳統(tǒng)PCR比較而言，擴增及檢測均在同一PCR管內完成，不需開蓋取樣檢測，不僅更靈敏、更特異，還省去了PCR產(chǎn)物的電泳檢測過程，最重要的是避免了具有致癌性的物質溴化乙錠（EB）的使用。所建立的方法檢測靈敏度達10copies／μL，因此，本方法更易檢測出潛伏期或早期羊口瘡臨床樣品中的病毒。中病毒拷貝數(shù)分別為1.35×108copies／μL和9.62×107copies／μL，陽性對照毒株抽提的DNA洗脫液中病毒拷貝數(shù)為2.33×107copies／μL。所建立的標準曲線斜率（Slope）為－3.809654，截距（Intercept）為50.380341，相關系數(shù)（R2）為0.998088（圖9）。

圖9 絕對定量標準曲線Fig.9 Standard curve

本文在建立標準曲線時，曾測定羊口瘡組織病料或羊口瘡病毒牛睪丸細胞培養(yǎng)物抽提的病毒DNA濃度，然后根據(jù)分子質量與質量濃度，計算出每微升DNA洗脫液中所含病毒拷貝數(shù)，并以此病毒拷貝數(shù)來建立絕對定量標準曲線，但在靈敏度試驗中，檢出的最低極限值僅為105個病毒拷貝數(shù)，檢出率明顯偏低。原因可能是組織或細胞樣品抽提出的是總DNA，其中含有很大一部分細胞或組織的基因組DNA，因而導致了OD260nm測定值偏高，最終換算出來的單位體積內抽提DNA樣品中所含病毒拷貝數(shù)要比真實的拷貝數(shù)多很多，才導致了極限檢出率偏低的誤差，因此本方法不可取。在以重組質粒為單位建立的標準曲線在最低檢測極限的試驗中，最低檢測極限可達10個病毒拷貝數(shù)，可能是因為抽提出的重組質粒DNA純度高，且片段比山羊痘病毒基因組DNA片段要小很多，因此與引物碰撞的幾率也要大很多，而事實上能否從送檢樣品抽提的DNA中檢測到10個真實的病毒還有待于進一步試驗證實。國內外有以抽提病毒DNA濃度換算病毒拷貝數(shù)為定量單位來進行絕對定量研究的報道，也有以重組質粒和病毒TCID50為單位的絕對定量研究報道。國外有建立羊口瘡病毒TaqMan re－al－time PCR文獻報道稱，為了盡可能模擬真實病毒基因組線性DNA，擴增、克隆一段比檢測目的DNA片段更長的DNA片段，酶切重組質粒，使其成為線性DNA，然后測定濃度，并以此已知拷貝數(shù)的線性DNA作為標準品建立標準曲線來定量檢測送檢樣品[9]。綜合分析評估看來，建立以病毒TCID50為單位的標準曲線來對病毒樣品進行絕對定量檢測要更準確、更有參考價值一些，其次以酶切的重組質粒作為標準品進行定量檢測，也可以作為一種病毒定量分析方法的參考。

本文在對所建立的羊口瘡病毒TaqMan探針法熒光定量PCR的特異性試驗中，未能收集到痘病毒科各屬代表病毒株，僅僅檢測了羊痘病毒屬的山羊痘病毒和禽痘病毒屬的雞痘病毒，有待收集更多其他痘病毒屬的毒株進行特異性試驗。在本文所建立方法的運用檢測中，臨床樣品數(shù)量偏少，有待收集更多的地方流行毒株進行檢測，以便進一步驗證該方法的可靠性。

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