六株傳染性支氣管炎病毒的生物學(xué)特性鑒定及遺傳進(jìn)化分析

龔 軍，鄭俏偉，王建華，楊 鳳，汪招雄，廖 明，任 濤

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動物疫病防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室廣東省動物源性人畜共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是雞的一種急性、高度接觸性、病毒性傳染病，目前該病已呈世界范圍流行，成為嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一[1－2]。雞傳染性支氣管炎的病原是傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV），該病毒屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），為有囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]，其主要的功能蛋白為纖突（spike，S）蛋白、膜（membrane，M）蛋白和核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白，S蛋白包括纖突蛋白1（spike1，S1）和纖突蛋白2（spike2，S2）兩個亞單位，其中S1蛋白是主要識別蛋白，與病毒的致病性相關(guān)。IBV在血清學(xué)和致病力方面都存在著差異，已報(bào)道的IBV血清型有30多個，其中包括引起呼吸道癥狀的血清型和腎病變的血清型，腺胃型、腸型、混合型正在研究之中[3]。這些血清型之間沒有或僅有部分交叉免疫性，同時由于新的血清型不斷出現(xiàn)，給本病的診斷和防控帶來很多困難[4－6]。本研究從華南地區(qū)分離了6株IBV，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，最后根據(jù)分離株S1基因序列，分析IBV的遺傳進(jìn)化，對雞傳染性支氣管炎的防控有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及雞胚 各廣東分離株標(biāo)號為GD－09II，GD－09III，GD－10I，GD－10II，GD－10III，GD－10IV，分離株背景見表1。

表1 分離株編號和背景Table1 Number and background of isolated strains

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）La Sota疫苗株為作者實(shí)驗(yàn)室保存毒株。

9日齡～11日齡無特定病原體（specific pathogen free，SPF）雞胚購自廣東永順生物制品有限公司。

1.1.2 試劑 TRizol、M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP，上海英濰捷基貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；pMD18－T Vector、Premix Ex Taq，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；胰酶、胎牛血清、M199培養(yǎng)基，Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離傳代 將病料加入含有雙抗（2000單位／mL）的滅菌生理鹽水在研缽中充分研磨，并反復(fù)凍融3次，5000r／min離心15min，取上清，微孔濾膜過濾除菌后，尿囊腔接種10日齡的SPF雞胚，每胚0.2mL，接種后置于37℃溫箱孵育，棄去24h之內(nèi)死胚，60h后收集尿囊液，繼續(xù)尿囊腔接種10日齡的SPF雞胚，如此盲傳5代，每一代對收獲的尿囊液做血凝（haemagglutination，HA）測定，并觀察雞胚病變。

1.2.2 雞胚矮小化試驗(yàn) 將傳代后的分離株尿囊液通過尿囊腔途徑接種于9日齡～10日齡的SPF雞胚，37℃孵育144h，觀察胚體發(fā)育情況。

1.2.3 新城疫病毒干擾試驗(yàn) 取各IBV分離株傳代后的尿囊液通過尿囊腔途徑接種5枚10日齡SPF雞胚，每胚0.2mL，接種后37℃孵育10h，然后各枚雞胚同一部位復(fù)種NDV La Sota弱毒株0.2 mL，接種后繼續(xù)孵育48h，收集尿囊液后逐胚測定其HA滴度。同時另設(shè)兩個試驗(yàn)對照組（生理鹽水及NDV La Sota株對照組），每組各5枚SPF雞胚，其中生理鹽水對照組每胚只接種生理鹽水0.2mL，NDV La Sota株對照組只接種NDV La Sota株0.2 mL，于37℃孵育48h后收集尿囊液并逐胚測定其HA滴度。

1.2.4 血凝特性試驗(yàn) 取各分離株傳代后的尿囊液毒以5000r／min離心15min后，取其上清，并分為2組，第1組經(jīng)10g／L的胰蛋白酶處理，于37℃水浴3h；第2組不用胰酶處理作為空白對照。測定兩組紅細(xì)胞凝集價。

1.2.5 雞胚氣管環(huán)感染試驗(yàn) 雞胚氣管環(huán)（ex vivo tracheal organ cultures，TOCs）感染試驗(yàn)參照吳延功的方法[7]，無菌取出18日齡～20日齡的SPF雞胚胚體于滅菌的平皿中，剪開頸部，用無菌的鑷子和眼科剪取出氣管置于另一滅菌平皿中，小心剝離氣管周圍的結(jié)締組織和脂肪，在含有200單位／mL雙抗的Hank’s液中清洗，用槍頭輕輕吹打數(shù)次，以清除氣管環(huán)中的分泌物，用鑷子夾住氣管的一頭，用眼科剪從另一頭將氣管剪成0.5mm～1mm的氣管環(huán)，棄掉鑷子夾過的部位，將剪好的氣管環(huán)置于不含血清的M199培養(yǎng)基中清洗，挑選合適厚度的氣管環(huán)置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1環(huán)，并加入1mL含20mL／L～30mL／L胎牛血清的M199培養(yǎng)液，置體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察，以氣管環(huán)內(nèi)上皮細(xì)胞完整和纖毛運(yùn)動活潑作為用于試驗(yàn)的判定指標(biāo)。用含20 mL／L～30mL／L胎牛血清的M199培養(yǎng)液將傳代后的各分離株尿囊液稀釋10倍，放入培養(yǎng)24h后合格的氣管環(huán)，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中感作1h后，傾去病毒稀釋液，加入含20mL／L～30mL／L胎牛血清的M199培養(yǎng)液2mL，繼續(xù)培養(yǎng)144h，每天觀察并記錄氣管環(huán)活性及纖毛運(yùn)動情況。

日糧中的蛋白質(zhì)含量過多或過少均會影響到骨骼發(fā)育，然而有學(xué)者指出，日糧蛋白水平對體尺的影響不顯著[3，12]。邱忠玉等[13]的研究也表明，12%～13%低蛋白日糧對蛋雞育成期脛長發(fā)育無顯著影響（P＞0.05）；郝文博等[14]研究蛋白水平同樣對雛雞脛長無顯著影響（P＞0.05）。這與本研究結(jié)果一致，本研究設(shè)定的四種日糧蛋白質(zhì)水平對京紅1號蛋種雞育成期脛長影響均無顯著差異(P＞0.05)，另外，隨日糧蛋白質(zhì)水平的增加對死淘率無顯著差異(P＞0.05)，表明設(shè)定的四種日糧蛋白質(zhì)水平梯度并未達(dá)到能夠顯著影響脛長和成活率的水平。

1.2.6 S1基因的克隆及測序 參照GenBank中已發(fā)表的IBV S1基因序列及8株IBV毒株（Beaudette、Mass41、Cal99、BJ、KQ6、GD／S14／2003、SAIBK、LX4）的全基因組序列，利用DNA Star 7.1軟件進(jìn)行同源性分析，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，引物由上海英濰捷基有限公司合成：

S1－F：5′－TTGAAAACTGAACAAAAGACCG－3′（22bp）

S1－R：5′－TACAAAACCTGCCATAACTAACAT－3′（24bp）

RNA抽提參照寶生物工程（大連）有限公司的Trizol試劑說明書進(jìn)行。RT反應(yīng)體系按Invitrogen公司提供的M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶的使用方法操作。50 μL PCR反應(yīng)體系如下：Premix Ex Taq 25μL；上、下游引物（20pmol／μL）各0.5μL；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 μL；無菌三蒸水20μL。循環(huán)參數(shù)為95℃3min，94℃30s，52℃30s，72℃2min，30個循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測分析。用寶生物工程（大連）有限公司的膠回收試劑盒對瓊脂糖凝膠目的條帶進(jìn)行回收純化，回收純化后產(chǎn)物與pMD18－T載體16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定的陽性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.7 S1基因序列分析 運(yùn)用 DNA Star 7.1、MEGA4等分子生物學(xué)分析軟件，將本研究的6株IBV分離毒株和GenBank中登錄的常用疫苗株和近年來國內(nèi)的主要基因型株及國際上其他血清型的部分代表參考株（表2）的S1基因的核苷酸序列進(jìn)行比對、繪制進(jìn)化樹和遺傳進(jìn)化分析。

表2 IBV參考株背景信息及其登錄號Table2 Background and GenBank accession numbers of IBV reference strains

2 結(jié)果

2.1 雞胚矮小化試驗(yàn)

尿囊腔接種各分離株的雞胚胚體病變明顯，尿囊膜增厚，緊裹胚體、胚體不同程度充血、尿囊液增多，雞胚發(fā)育受阻、爪趾變形抱緊頭部、胚體卷曲成球形，呈現(xiàn)典型的侏儒胚（圖1）。

圖1 雞胚矮小化試驗(yàn)Fig.1 Virus pathological lesions to chicken embryo

2.2 新城疫病毒干擾試驗(yàn)

NDV La Sota株對照組雞胚尿囊液HA滴度均高于1∶29，生理鹽水對照組無血凝性，6株分離株雞胚尿囊液的HA滴度均小，1∶26，遠(yuǎn)小于NDV La Sota株試驗(yàn)組HA平均滴度，說明這6株分離株均對NDV的增殖產(chǎn)生明顯的干擾作用。

2.3 血凝特性試驗(yàn)

未經(jīng)胰酶處理的各分離株雞胚尿囊液，對雞紅細(xì)胞無凝集作用；經(jīng)10g／L胰酶處理的雞胚尿囊液，對雞紅細(xì)胞的凝集價在1∶25～1∶27之間。

2.4 雞胚氣管環(huán)感染試驗(yàn)

正常氣管環(huán)輪廓清晰，管壁略顯透明，腔內(nèi)無雜質(zhì)，內(nèi)壁上皮細(xì)胞完整，纖毛擺動活躍；攻毒后的氣管環(huán)出現(xiàn)明顯的病變，輪廓模糊，管壁顏色加深，腔內(nèi)污濁，充滿脫落的的上皮細(xì)胞和氣泡，纖毛停止擺動（圖2）。

2.5 S1基因的遺傳進(jìn)化分析

利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT－PCR，成功擴(kuò)增出6株IBV分離株的S1基因，瓊脂糖凝膠電泳在1620 bp左右有明顯的亮帶（圖3）。

根據(jù)IBV分離株和參考株的S1基因的核苷酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹（圖4）。遺傳進(jìn)化樹顯示，6株IBV分離株和18株參考株的S1基因整體分為兩個大群。其中包括大部分疫苗株在內(nèi)的16參考株和1株分離株GD－09Ⅱ位于第一大群；而5株分離株和LX4、LGD－03I位于第二大群，其中5株分離株與LX4株的關(guān)系最近。這6株IBV于近兩年分離自廣東不同地區(qū)，其中5株與Mass基因型親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，目前國內(nèi)使用的主要是 Mass型的H52和H120疫苗，這些疫苗的使用導(dǎo)致免疫失敗或免疫效果不理想，與目前流行的IBV的基因型不無關(guān)系。

圖2 雞胚氣管環(huán)感染試驗(yàn)Fig.2 Infection of TOCs

圖3 IBV分離株的S1基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophdresis ofPCR products of S1gene of IBV isolates

圖4 根據(jù)S1基因繪制的遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the sequence of the S1gene of the IBV isolates

3 討論

IBV的S1基因是主要免疫原基因，其蛋白可誘導(dǎo)HI抗體及病毒中和抗體的產(chǎn)生，血清型特異抗體也主要由其誘導(dǎo)產(chǎn)生。IBV的變異主要體現(xiàn)在S蛋白，而S1蛋白是IBV基因組中最易發(fā)生變異的部位，S1基因的點(diǎn)突變、插入和缺失是造成IBV毒株變異的主要原因之一，并且S1基因重要抗原位點(diǎn)的變異可引起IBV新血清型的不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致了IBV的復(fù)雜的血清型。所以，對IBV的分子流行病學(xué)研究大都集中在S1基因上。

弱毒疫苗和滅活疫苗的廣泛使用，使得IB得到有效的控制，但是，仍有腎型傳支不斷出現(xiàn)[6]。我國主要使用Mass血清型的H120和H52弱毒疫苗株，有些雞群也使用嗜腎型毒株制備的滅活疫苗[8－12]。一些經(jīng)過 Mass型疫苗免疫接種的雞群持續(xù)地出現(xiàn)IB的暴發(fā)，導(dǎo)致免疫雞群出現(xiàn)發(fā)病和品質(zhì)下降等問題。近年來通過對中國免疫雞群中分離到的IBV毒株的研究顯示，免疫雞群中IBV毒株的進(jìn)化產(chǎn)生的變異株使得疫苗免疫保護(hù)效果顯著下降。

本研究對2009年和2010年分離自廣東地區(qū)的6株IBV進(jìn)行生物學(xué)特性研究，并成功擴(kuò)增出S1基因，根據(jù)GenBank中登錄的參考株，繪制了S1基因遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，6株分離株中的大部分不與疫苗株位于同一大群，而國內(nèi)目前使用的疫苗為H52和H120弱毒疫苗，疫苗株和流行株的差異可能是導(dǎo)致免疫效果不理想的主要原因，因此，目前國內(nèi)急需尋找開發(fā)一種針對中國基因型的免疫保護(hù)效果較好的疫苗株。

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