豬圓環(huán)病毒2型的分離鑒定及全基因組克隆和序列分析

王 赟，梅 淼，楊 雪，朱 玲

（四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心，四川 雅安 625014）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV－2）作為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）的主要病原體，已被世界各國的學者所認同[1]。PMWS發(fā)生自1991年在加拿大被首次報道后，美國、法國、西班牙、德國、日本都進行了報道，在北美和歐洲的豬群中，發(fā)病率占被侵襲豬群的5%～50%，病死率達到50%～100%[2－3]。病原學和血清學調(diào)查證實，PCV－2呈世界性分布[4]。根據(jù)致病性、抗原性和核苷酸序列，PCV可分為PCV－1和PCV－2兩個血清型，PCV－1無致病性，PCV－2有致病性。國內(nèi)外研究表明，PCV－1基因胞為1759bp，PCV－2則有1767bp和1768bp兩種[5]。PCV－2毒株間核苷酸序列的相似性大于96%，PCV－2與PCV－1的相似性小于80%。世界各地的PCV－2分離株的核苷酸序列具有很高的同源性，但在不同地域間病毒基因組序列仍存在變異，這種差異可能與PCV－2的感染特性有關(guān)[6]。該病的主要癥狀為漸進性消瘦，呼吸困難及黃疸，剖檢可見淋巴組織退化，間質(zhì)性肺炎，肝炎及腎炎。除了能引起PMWS之外，PCV－2還與豬的幾種新出現(xiàn)傳染病的發(fā)生密切相關(guān)，包括豬呼吸道病綜合征（PRDC）及豬增生性和壞死性肺炎（PNP）、新生仔豬的先天性震顫（CT）和新生仔豬的腹瀉病等[7]。2000年郎洪武等[8]首次報道中國豬群存在PCV－2感染，感染率為42.9%。而2007年周緒斌等[8]報道在2000年－2005年期間20多個省市PCV－2感染平均陽性率達55.04%。如今PCV－2及其所致的相關(guān)疾病引起了獸醫(yī)界的高度重視，成為當前研究的熱點。

本試驗從所采典型PMWS病料中分離鑒定出PCV－2，并對PCV－2全基因組的擴增、克隆和序列分析，并與GenBank中的PCV－2參考毒株進行同源性比較，以期為四川省PCV－2的流行病學研究、診斷與防控、基因組學的完善，及其進一步闡明其致病機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 選疑似典型斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病例的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織，病料采集自四川某規(guī)?；i場，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 細胞、質(zhì)粒、菌種 PK－15細胞購自武漢病毒所細胞保管中心（經(jīng)PCV－1及PCV－2檢測為陰性），限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ、HindⅢ、pMD18－T Simple載體（寶生物工程大連有限公司），DH5α宿主菌，四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心保存。

1.1.3 引物設(shè)計 采用Fenaux M 等[10]所設(shè)計用于擴增PCV－2全基因組為1767bp或1768bp的特異引物序列，擴增四川省PCV－2毒株的全基因組，并在上下游引物中引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位點，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物 序 列 為 P1，5′－GAAGGATCCCTGGCTAACTTTGAAAGT－3′；P2，5′－GCAAAGCTTAATTCTGACAACGTTACA－3′。

1.2 方法

1.2.1 病料的PCR擴增 將采集的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等病料，剪成小塊，移入勻漿器內(nèi)，按1∶10（W／V）加入PBS液將其研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，反復凍融3次。按常規(guī)的酚／氯仿法提取病毒基因組DNA，并以提取的目的DNA為模板進行如下PCR擴增：50μL反應體系（5μL10×bufffer、3μL 25mmol／L MgCl2、1μL 10mmol／L dNTPs、20 μmol／L P1和P2各1.0μL、Taq酶0.5μL、模板3 μL、超純水補足50μL），于94℃變性5min，然后進行30個循環(huán)（94℃1min，56℃1min，72℃30s），最后72℃延伸10min。用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結(jié)果。

1.2.2 PK－15細胞PCV－1、PCV－2污染測定 取出1mL經(jīng)胰酶消化完全的單層PK－15細胞懸液，反復凍融3次，讓細胞充分破裂，完全釋放出病毒粒子。12000r／min 4℃離心5min，取上清液備用。按照1.2.1的PCR反應體系來檢測PK－15細胞是否含有PCV－1、PCV－2核酸污染，選擇檢測結(jié)果為陰性的單層細胞備用。

1.2.3 病毒的分離 用無菌PBS液將經(jīng)1.2.1檢測為PCV－2陽性的相對應的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等病料研磨制成1∶5（病料與PBS液體積比）的懸液，反復凍融3次，4000r／min離心30min，取上清過0.22μm濾器除菌，加入青霉素1000單位／mL，鏈霉素1000μg／mL，4℃作用6h，保存?zhèn)溆?。取上述處理好的組織樣品1mL，接種按常規(guī)方法消化制備致密PK－l5細胞單層，同時設(shè)不接種病毒的PK－15細胞作空白對照，37℃吸附作用1h，加入適量含20 mL／L小牛血清的維持營養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)72h。將培養(yǎng)物反復凍融3次，3000r／min離心10min，收獲上清。用上一代細胞病毒液再接種細胞連續(xù)盲傳15代后收獲病毒。

1.2.4 熒光抗體染色法檢測 將已收獲的病毒接種長有致密單層的PK－15細胞[11]，按熒光抗體染色法檢測的標準步驟制備樣品，最后經(jīng)超純水沖洗，冷風吹干，以0.5mol／L pH9.5的碳酸鹽緩沖甘油封固蓋片，鏡檢，觀察有無特異性熒光。

1.2.5 分離株的鑒定及全基因組的克隆 取出已經(jīng)長成單層的接有病毒的PK－15細胞反復凍融3次，讓細胞充分破裂，釋放出病毒。在4℃以12000 r／min離心5min，取上清液，按照以上PCR反應體系檢測，如果電泳結(jié)果為陽性則用PCR回收試劑盒回收特異的擴增片段。將回收的基因片段與克隆載體pMD18－T Simple連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。重組質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定，產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 序列測定與全序列進化分析 對經(jīng)酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往上海英俊生物有限公司測序。然后利用DNA Star軟件分析所得PCV－2的基因組序列并與Gen Bank中公布的其他國內(nèi)外毒株進行序列比較分析和進化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離

病毒在接種PK－15細胞后的間接免疫熒光方法檢測結(jié)果顯示：感染病毒的陽性細胞呈現(xiàn)綠色熒光，病毒抗原主要集中在細胞核區(qū)，細胞質(zhì)中也有許多抗原分布，病毒感染的陽性細胞呈散在分布；陰性對照細胞中未見熒光（圖1）。

2.2 PCV－2全基因組擴增結(jié)果及重組質(zhì)粒的酶切鑒定

應用合成的引物通過反向PCR擴增出長度約為1800bp的片段，與預期目的片段大小一致（圖2）。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，顯示出長度約為2600 bp和1800bp的特異性片段，結(jié)果表明克隆成功（圖3）。

圖1 間接免疫熒光鑒定PCV－2病毒粒子在PK－15細胞中的增殖Fig.1 Immunofluorescence identification of infection on PK－15cells infected with PCV－2

圖2 PCR擴增結(jié)果Fig.2 The results of PCR amplication

2.3 序列測定與分析

陽性重組質(zhì)粒經(jīng)上海英俊生物有限公司測序，去除酶切位點及保護性堿基，得到長為1767bp的外源片段，該片段與預期結(jié)果完全相符（圖3）。通過BLAST與GenBank中來自加拿大、新西蘭及中國其他部分的PCV－2毒株進行相似性比較分析，結(jié)果與13個毒株間的相似性介于95.2%～99.5%（圖4）。該結(jié)果表明從所采病料中成功分離了PCV－2四川株。PCV2－SC分離株與山東株（AY556473）親緣關(guān)系最近，相似性高達99.7%；與日本株（AY424401）親緣關(guān)系最遠，相似性只有94.8%。根據(jù)比較結(jié)果繪制系統(tǒng)進化樹（圖5），可以看出澳大利亞株（AY424401）構(gòu)成了一個獨立的分支，PCV2－SC株分離株與山東株共同組成一組微小分支，且這兩株與加拿大株、新西蘭株和中國的其他分離株構(gòu)成了另外一個大的分支?？傮w看來，由于地域原因，國內(nèi)毒株同源性均較高，且與國外毒株新西蘭株同源性較近。

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

圖4 PCV－2（SC）與其它PCV－2毒株的相似性比較Fig.4 Similarity comparison of the full genome sequence of PCV－2（SC）strain with other PCV－2isolates

圖5 PCV－2－SC全基因組系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Phylogenetic tree based on complete genome sequence of PCV－2－SC strain

3 討論

PMWS是近10多年來出現(xiàn)的影響世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，PCV－2是引起該病的主要病原，但不是惟一病原，PCV－2單獨感染可出現(xiàn)輕微的病變[12]。臨床上出現(xiàn)的PMWS病例多為PCV－2、豬細小病毒（PPV）及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的混合感染，尤其是最近幾年暴發(fā)的豬高致病性藍耳?。锤咧虏⌒载i繁殖與呼吸綜合征），更是伴隨有 PCV－2 的感染[13－14]。在對 PCV－2進行分離鑒定時考慮了兩個問題，即克服PCV－1的干擾和檢測方法的準確性。在試驗中選擇經(jīng)能區(qū)分PCV－1和PCV－2的PCR特異引物檢測PK－15細胞是否含有PCV－1和PCV－2污染，檢測結(jié)果為陰性后。間接免疫熒光試驗檢測經(jīng)接種PCV－2－SC株的PK15細胞，盲傳培養(yǎng)15代次后獲得了滿意結(jié)果。

在設(shè)計引物時通過反復比較PCV－1和PCV－2的序列差異，選擇在PCV－1和PCV－2毒株間變異較大，相對于PCV－2毒株間保守性較高的區(qū)域，設(shè)計出針對PCV－2的特異性引物P1，P2一次性擴增獲得了1800bp左右的目的片段。既克服了病毒細胞培養(yǎng)過程可能引入的污染，又避免了因病毒對細胞的適應性而進行的多次反復傳代，同時一次擴增克隆PCV－2全基因組還減少了分段擴增克降所需的多次基因操作。PCR反應擴增克隆測定PCV－2－SC株序列，與GenBank中的13株參考序列進行比較分析發(fā)現(xiàn)，相似性介于95.2%～99.5%。PCV－2－SC分離株與本次比較的山東株（AY556473）親緣關(guān)系最近，相似性高達99.7%；與日本株（AY424401）相似性只有94.8%。但總體來說，不同分離株之間核苷酸水平的變異性比較小，各PCV－2分離株基因組之間總體上比較保守。但也存在著變異，變異的發(fā)生與地理位置和種豬來源不同有某種程度上的相關(guān)性。尹業(yè)師等[15]曾對2005年12月31日前GenBank中的253條PCV－2序列進行同源性比較和遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)在核苷酸水平上PCV－分為兩個亞型，其中亞型1是以分離自美國、加拿大、澳大利亞的毒株為代表，亞型2是以分離自法國和新西蘭的毒株為代表。本研究所分離的PCV－2序列與新西蘭代表株在同一分支，而與日本，加拿大和澳大利亞株不在同一分支，這說明本研究所得的流行毒株與新西蘭代表株親緣關(guān)系較近。本文的進化樹分析表明國內(nèi)外的毒株均形成了幾個小的分支，表明不同地區(qū)的PCV－2分離株在基因組序列上存在一定的變異，可能存在地域上的相關(guān)性。

本研究是從一批典型PMWS的住群眾分離到的，且全基因組的與GenBank上已提交的序列相似性分析顯示，該毒株并不與國內(nèi)外已分離的任何一株序列完全相同，因此可認為該毒株的分離鑒定具有地方的代表性。本研究成功分離到了PCV－2四川分離株，為進一步從分子水平研究PCV－2在四川省的流行、變異規(guī)律以及主要結(jié)構(gòu)基因的特性等提供了參考數(shù)據(jù)，也為PCV－2的診斷及預防奠定了良好基礎(chǔ)。

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