傳染性法氏囊病病毒NN1107廣西株的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

李 軍，陶 立，蘭美益，陳澤祥，韋志鋒，秦若甫，彭 昊，楊 威＊

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001）

傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）是雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）的病原體。IBDV感染幼齡雞后，主要在法氏囊髓質(zhì)區(qū)的未成熟B淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞中增殖，引起感染細(xì)胞的變性和壞死，臨床上出現(xiàn)以法氏囊水腫、出血和萎縮為特征的病理變化[1－2]。IBDV在雞群中的傳播不僅導(dǎo)致易感雞群的大量死亡，IBDV的殺淋巴細(xì)胞作用還能引起雞群的免疫應(yīng)答能力降低，使雞群對(duì)其他病毒或細(xì)菌感染的敏感性增加，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3－4]。近十幾年來(lái)，隨著IBDV疫苗的廣泛應(yīng)用，IBDV在疫苗免疫選擇壓力下，自身不斷發(fā)生變異，毒力獲得增強(qiáng)，出現(xiàn)經(jīng)典毒株（classical IBDV，cIBDV）向超強(qiáng)毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）的演化，vvIBDV可以突破高水平的母源抗體保護(hù)，導(dǎo)致雞發(fā)病年齡提前和病死率增高，給IBD的防控帶來(lái)了困難。

IBDV屬于雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬成員，基因組由A、B兩個(gè)雙鏈RNA片段組成[5]。A片段的VP2基因是IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2的編碼基因，VP2蛋白位于病毒粒子的外表面，是IBDV的主要毒力因子，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[6]。研究證實(shí)VP2序列中的VP2高變區(qū)（vVP2）與IBDV的毒力密切相關(guān)。vVP2位于VP2蛋白的第206～350位氨基酸之間，由大小兩個(gè)親水區(qū)和一個(gè)七肽區(qū)組成，構(gòu)成一個(gè)構(gòu)象依賴型的抗原表位，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。vVP2內(nèi)氨基酸的改變會(huì)引起IBDV 毒力的改變[7－9]。

陽(yáng)秀英等和何秀苗等2000年—2007年對(duì)廣西雞群IBDV的分子流行病學(xué)研究表明，廣西雞群中主要流行vvIBDV，各地毒株來(lái)源復(fù)雜，部分IBDV毒株的抗原性可能發(fā)生漂移[10－11]。2011年7月，廣西南寧市某養(yǎng)雞場(chǎng)飼養(yǎng)的23日齡三黃雞暴發(fā)了一起IBD，病死率為6%。本研究對(duì)病死雞進(jìn)行了IBDV分離和鑒定，并對(duì)其vVP2進(jìn)行克隆和測(cè)序，將獲得的vVP2序列與廣西流行的IBDV毒株vVP2序列進(jìn)行比較分析，建立遺傳進(jìn)化樹(shù)，從分子水平上對(duì)廣西近期IBDV的變異情況進(jìn)行追蹤和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來(lái)自廣西南寧市某養(yǎng)雞場(chǎng)的臨床疑似IBD的病死雞，采其法氏囊作為病料。

1.1.2 雞胚 9日齡健康雞胚，購(gòu)自廣西華桂源種禽有限公司。

1.1.3 試劑和儀器 PCR Taq mix、DNA Marker 1、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；病毒基因組DNA／RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18－T載體、RNA酶抑制劑和 MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR儀購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 病毒的分離方法按陽(yáng)秀英等的方法進(jìn)行[10]。

1.2.2 病毒分離株RNA的提取 用病毒基因組DNA／RNA提取試劑盒提取接種病毒的雞胚尿囊液中的總RNA，方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 病毒分離株vVP2基因的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序按韋平等的方法進(jìn)行IBDV的RT－PCR檢測(cè)[12]。利用DNA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥占兓笈cpMD－18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 分離株vVP2序列的遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用DNA Star軟件包的MegAlign軟件對(duì)測(cè)序獲得的vVP2片段序列與GenBank登錄的5株IBDV疫苗株和26株2000年—2010年在廣西流行的IBDV野毒株的vVP2序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸的序列比較和同源性分析，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。分析中應(yīng)用的毒株信息見(jiàn)表1。

表1 所用的IBDV毒株信息Table1 The information of IBDV strains used in this study

2 結(jié)果

2.1 病毒分離和鑒定

發(fā)病雞的法氏囊研磨過(guò)濾后經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種9日齡健康雞胚，雞胚在43h后死亡，胚體表現(xiàn)為水腫和出血。取尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)和細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)均為陰性。應(yīng)用韋平等[12]的方法對(duì)雞胚尿囊液進(jìn)行IBDV的RT－PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出471bp的目的片段，證實(shí)從病料中分離到了IBDV，將此毒株命名為NN1107。

2.2 分離株vVP2序列的比較分析

2.2.1 核苷酸序列同源性比較 對(duì)NN1107分離株的vVP2進(jìn)行克隆和測(cè)序，獲得了NN1107分離株vVP2核苷酸序列，長(zhǎng)度為471bp。對(duì)序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)檢測(cè)，在271位核苷酸處有一個(gè)vvIBDV的特征性SspI酶切位點(diǎn)。將此序列與廣西野毒株和疫苗株的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，NN11017株與廣西vvIBDV毒株的同源性在96%～99.6%之間，其中與野毒株 NN07122和HP1001的同源性最高，為99.6%。NN1107株與廣西cIBDV毒株的同源性在90.3%～91.6%之間；與疫苗株的同源性則在90.3%～96.6%之間。

2.2.2 氨基酸序列同源性比較 將推導(dǎo)的氨基酸序列與廣西野毒株和疫苗株的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，NN1107株與廣西vvIBDV毒株的同源性在94.9%～99.4%之間，其中與野毒株 BH09、NNTZ（3）、NN07122和 HP1001的同源性最高，為99.4%。NN1107株與廣西cIBDV毒株的同源性在91.1%～93%之間；而與疫苗株的同源性在91.8%～97.5%之間，其中與 B87（in）、Bursine－2、FW2512株的同源性均為91.8%；與 B87（BJ）和MB株的同源性則為93%和97.5%。

2.2.3 氨基酸序列分析 NN1107株vVP2氨基酸序列中與病毒毒力和抗原相關(guān)的氨基酸均符合vvIBDV 特 征[13－14]，即第326～332位的七肽區(qū)SWSASGS序列保持不變；大親水一區(qū)（第212～224位氨基酸）內(nèi)212、213、214和222位氨基酸為N、D、Y和A；大親水二區(qū)（第314～324位氨基酸）內(nèi)318、321、323和324位氨基酸為G、G、D和Q；小親水一區(qū)（第248～252位氨基酸）內(nèi)249位氨基酸為Q；小親水二區(qū)（第279～290位氨基酸）279和284位氨基酸為D和T。其他與病毒毒力和抗原相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)，如第242、253、254、256、270、294、299和330位氨基酸分別為I、Q、G、I、A、I、S和S。NN1107株與廣西部分野毒株和疫苗株的vVP2氨基酸序列比較見(jiàn)圖1。

圖1 vVP2的氨基酸序列比較Fig.1 Comparison of the amino acid sequences of vVP2

2.3 分離株vVP2序列的遺傳進(jìn)化分析

將NN1107株與5株IBDV疫苗株和26株2000年—2010年在廣西流行的IBDV野毒株的vVP2核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖2）。可以發(fā)現(xiàn)遺傳進(jìn)化樹(shù)由vvIBDV毒株、cIBDV毒株和疫苗株3個(gè)群組成，群間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。NN1001株屬于vvIBDV毒株群，它與曾經(jīng)在2004年、2005年、2007年和2010年流行的毒株BH09、NNTZ（3）、NN07122、HP1001的親緣關(guān)系最近，共同組成亞群2；而2006年、2007年和2010年的大部分毒株以及2004年至2005年流行的大部分毒株分別組成亞群1和亞群3。

圖2 根據(jù)vVP2核苷酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of isolate and reference strains based on the nucleotide sequences of vVP2

3 討論

采用雞胚絨毛尿囊膜接種和RT－PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)臨床疑似IBD的病死雞法氏囊進(jìn)行IBDV的分離和鑒定，成功分離出一株IBDV（NN1107株）。對(duì)NN1107分離株vVP2片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，序列分析和同源性比較結(jié)果顯示，NN1107株具有vvIBDV的特征性酶切位點(diǎn)SspI，且與廣西vvIBDV野毒株的同源性極高，表明NN1107株為一株vvIBDV。

VP2蛋白不僅是IBDV的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，還是一個(gè)變異最大的蛋白，其變異主要集中在vVP2區(qū)域（第206～350位氨基酸），vVP2內(nèi)氨基酸的改變都有可能使病毒的毒力增強(qiáng)，突破疫苗的免疫保護(hù)[7－9]。因此，可以通過(guò)vVP2序列的同源性比較來(lái)分析毒株的遺傳進(jìn)化。vVP2氨基酸序列同源性比較和遺傳進(jìn)化分析顯示，在近10年，廣西同時(shí)存在著cIBDV和vvIBDV兩種不同毒力的IBDV毒株流行。本研究分析的27株IBDV毒株中，只有7株毒株屬于cIBDV，且毒株大都分離于2005年以前，只有1株BB0901是分離于2009年；而vvIBDV毒株分離自2004年至2011年，表明廣西目前IBDV的主要流行毒株仍然為vvIBDV。

NN1107株與2004年毒株BH09、2005年毒株NNTZ（3）、2007年毒株 NN07122和2010年毒株HP1001的同源性高達(dá)99.4%；其主要氨基酸位點(diǎn)也未發(fā)生任何改變，說(shuō)明這些毒株很有可能來(lái)源于同一病毒株的進(jìn)化。本研究構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)也顯示vvIBDV在進(jìn)化中也分成2個(gè)亞群，在同一地區(qū)，如位于桂南地區(qū)的南寧市和位于桂北地區(qū)的桂林市都存在有不同亞群的vvIBDV，表明廣西vvIBDV來(lái)源復(fù)雜，流行不受地域限制。

從vVP2核苷酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹(shù)可以看出，NN1107株等vvIBDV毒株與傳統(tǒng)的疫苗株B87（in）、Bursine－2、FW2512株分屬于兩個(gè)基因群。在與病毒毒力和抗原相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)中，有10個(gè)位點(diǎn)，即第212、222、249、256、270、279、284、286、294和299位的氨基酸發(fā)生了改變。這些氨基酸的改變可能會(huì)導(dǎo)致中和抗體識(shí)別的抗原表位發(fā)生構(gòu)象上的變化，使疫苗株 B87（in）、Bursine－2、FW2512株誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體不能有效地與病毒結(jié)合，阻斷vvIBDV感染B淋巴細(xì)胞，這可能是vvIBDV突破高水平母源抗體保護(hù)的原因。

[1]Lukert P D，Saif Y M.Infectious Bursal Disease[M].In：Calnek B W，Barnes H J，Beard C W，et al（Eds），Diseases of Poultry（10th ed.）.Iowa State Universuty Press，1997：721－738.

[2]毛炳宇，馬曉麗，趙 暉，等.人工感染IBDV雞法氏囊的電鏡研究 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，29（5）：455－461.

[3]Imai K，Mase M，Tsukamoto K，et al.Persistent infection with chicken anaemia virus and some effects of highly virulent infectious bursal disease virus infection on its persistency[J].Res Vet Sci，1999，67（3）：233－238.

[4]Bautista D A，Elankumaran S，Heckert R A.Effect of a variant infectious bursal disease virus（E／Del）on Salmonella typhimuriuminfection in commercial broiler chickens[J].Avian Dis，2004，48（2）：361－369.

[5]Hudson P J，McKern N M，Power B E，et al.Genomic structure of the large RNA segment of infectious bursal disease virus[J].Nucleic Acids Res，1986，14：5001－5012.

[6]Fernandez－Arias A，Martinez S，Rodriguez J F.The major antigenic protein of infectious bursal disease virus，VP2，is an apoptotic inducer[J].J Virol，1997，71：8014－8018.

[7]Bayliss C D，Spies K U，Shaw R W，et al.A comparison ofthe sequences of segment A of four infectious bursal disease virus strains and identification of a variable region in VP2[J].J Gen Virol，1990，71（Pt6）：1303－1312.

[8]Schnitzler D，Bernstein F，Müller H，et al.The genetic basis for the antigenicity of the VP2protein of the infectious bursal disease virus[J].J Gen Viro，1993，74（Pt 8）：1563－1571.

[9]Eterradossi N，Arnauld C，Toquin D，et al.Critical amino acid changes in VP2variable domain are associated with typical and atypical antigenicity in very virulent infectious bursal disease viruses[J].Arch Virol，1998，143（8）：1627－1636.

[10]陽(yáng)秀英，韋 平，黃志永，等.我國(guó)部分省區(qū)雞傳染性法氏囊病病毒的分子流行病學(xué)研究 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（6）：581－588.

[11]何秀苗，韋 平，官丁明，等.2000～2007年廣西雞傳染性法氏囊病病毒的分子流行病學(xué) [J].病毒學(xué)報(bào)，2009，25（6）：437－444.

[12]韋 平，龍進(jìn)學(xué)，陽(yáng)秀英，等.傳染性法氏囊病病毒快速檢測(cè)與分型技術(shù)的研究 [J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24（4）：313－316.

[13]許信剛，李健強(qiáng)，王笑梅，等.傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒HZ株和XN株VP2基因的克隆和序列比較分析 [J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2000，21（1）：39－42.

[14]曹永長(zhǎng)，畢英佐，梁志清，等.超強(qiáng)傳染性法氏囊病病毒宿主保護(hù)抗原的分子特征 [J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18（6）：521－526.