崔黎明,張曉天,胡 亞,王槐棟,王 放
血栓心脈寧片是純中藥制劑,主要由川芎、丹參、水蛭、毛冬青、牛黃、麝香、槐花、人參莖葉皂苷、冰片、蟾酥等組成。具有活血化瘀,擴(kuò)張血管,抑制血小板、紅細(xì)胞聚集,降低血黏度,降低血脂,改善局部和全身血液循環(huán)及防治血栓的功效[1],臨床主治腦血栓、冠心病、心絞痛等血瘀證者[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察血栓心脈寧片對(duì)大鼠血漿α顆粒膜蛋白(GMP-140)及血管性血友病因子(vWF)的影響,探討血栓心脈寧片的作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用和推廣提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠60只,雌、雄各半,體重200 g~220 g,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供,質(zhì)量合格證號(hào):SCXK-(吉)2009-0001。
1.2 藥品 血栓心脈寧片,吉林華康藥業(yè)股份有限公司提供,國藥準(zhǔn)字Z20030145,產(chǎn)品批號(hào):110601;腦心通膠囊,陜西步長制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字Z2025001,產(chǎn)品批號(hào):110764。
1.3 主要試劑和儀器 鹽酸腎上腺素注射液,上海禾豐制藥有限公司出品,批號(hào):110302;GMP-140 ELISA檢測(cè)試劑盒,購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司的R&D Systems分裝試劑盒,批號(hào):20110701A;大鼠vWF ELISA檢測(cè)試劑盒,購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司的R&D Systems分裝試劑盒,批號(hào):20110701A;TDL80-2B飛鴿牌離心機(jī),哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;瑞士帝肯TECAN SUNRISE酶標(biāo)儀,早稻田(北京)生物科技發(fā)展有限公司。
1.4 動(dòng)物分組 取血栓心脈寧片,配成濃度為3.5%、7.0%、14.0%高、中、低3個(gè)劑量的供試藥液;腦心通膠囊,配成濃度為8.0%的陽性對(duì)照藥液;腎上腺素,配成濃度為0.1%的溶液;水合氯醛,配成濃度為10%的溶液。
自試驗(yàn)動(dòng)物中心引入 Wistar大鼠后,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,室溫22℃~25℃,濕度40%~60%。將大鼠按體重隨機(jī)分為6組,每組10只,雌、雄各組均分,分組為正常對(duì)照組、血瘀模型組及血栓心脈寧片高劑量組1.40 g/kg、中劑量組0.70 g/kg、低劑量組0.35 g/kg,腦心通膠囊陽性對(duì)照組0.80 g/kg。
試驗(yàn)過程中正常對(duì)照組正常飼養(yǎng),血瘀模型組給水10 mL/kg,各給藥組均給予10 mL/kg供試藥液。每日09:00時(shí)灌胃給藥,連續(xù)給藥7 d。
1.5 血瘀模型的制備 第6天灌胃給藥后30 min,除正常對(duì)照組外,其余各組動(dòng)物均皮下注射0.1%腎上腺素0.8mL/kg,2 h后于冰水中浸泡5 min,再過2 h后給予同劑量的腎上腺素以復(fù)制急性血瘀模型[3]。
1.6 血漿GMP-140、v WF含量的測(cè)定 大鼠復(fù)制急性血瘀模型后,禁食不禁水12 h,第7天末次給藥30 min后,腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉,腹主動(dòng)脈取血[4],置于肝素抗凝管中。3 000 r/min離心30 min,吸取上層血漿按照GMP-140、v WF ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作,測(cè)定大鼠血漿含量。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。
2.1 對(duì)血漿GMP-140含量的影響 急性血瘀模型組與正常對(duì)照組比較,其血漿GMP-140含量明顯增加(P<0.05),提示大鼠急性血瘀模型造模成功。與急性血瘀模型組比較,血栓心脈寧片低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠GMP-140含量降低(P<0.05)。詳見表1。
2.2 對(duì)血漿v WF含量的影響(見表1)
表1 血栓心脈寧片對(duì)急性血瘀大鼠血漿GMP-140及vWF的影響 (±s)
表1 血栓心脈寧片對(duì)急性血瘀大鼠血漿GMP-140及vWF的影響 (±s)
與模型組比較,1)P<0.05
mL正常對(duì)照組 10 - 1.4±0.21) 950±671)組別 n 劑量 GMP-140 ng/mL v WF pg/模型組 10 - 2.4±0.5 1 203±166低劑量組 10 0.35 g/kg 1.6±0.51) 1 074±541)中劑量組 10 0.70 g/kg 1.1±0.31) 886±1731)高劑量組 10 1.40 g/kg 1.6±0.41) 931±891)陽性對(duì)照組 10 0.80 g/kg 0.7±0.31) 901±981)
中醫(yī)辨證為血瘀證者其臨床表現(xiàn)主要為疼痛、腫塊、瘀斑、氣虛等癥候。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為,血瘀證是由于血液瘀滯、運(yùn)行不暢而產(chǎn)生的病理癥候[5,6]。本實(shí)驗(yàn)給大鼠皮下注射大劑量腎上腺素模擬暴怒時(shí)的機(jī)體狀態(tài),以冰水浸泡法模擬外寒侵襲,在兩種因素綜合作用下復(fù)制大鼠急性血瘀證模型,此模型使外周血管強(qiáng)烈收縮,心臟后負(fù)荷增加,心肌耗氧量增加,心功能逐漸下降,使血液運(yùn)行障礙[7],因此,該模型常用于中醫(yī)血瘀證及活血化瘀藥的研究[8,9]。王宏等[10]通過此模型證實(shí)血栓心脈寧片對(duì)急性血瘀模型大鼠血液黏度、血小板聚集及血液流變學(xué)的異常變化有明顯改善作用。何小溪等[11]證實(shí),人參Rb組皂苷對(duì)急性血瘀模型大鼠血液黏度、血小板聚集及血液流變學(xué)的異常變化有明顯改善作用。腎上腺素加冰水以復(fù)制急性血瘀動(dòng)物模型的方法可行。
GMP-1 4 0是血小板α顆粒膜蛋白,是一種分子量為14 000的黏附蛋白,富含有半胱氨酸,高度糖化的整合蛋白質(zhì)。GMP-140位于靜止血小板顆粒膜上,當(dāng)血小板受刺激活化時(shí)隨α顆粒內(nèi)容物的釋放而與質(zhì)膜融合,能持久存在于活化血小板質(zhì)膜表面,具有介導(dǎo)活化血小板或內(nèi)皮細(xì)胞與多種不同類型白細(xì)胞相互黏附的功能[12]。GMP-140只有在活化的血小板表面表達(dá),并可釋放至血漿中[13],可促進(jìn)單核細(xì)胞的識(shí)別,參與炎癥與血栓形成,是目前最具特異性血小板活化的分子標(biāo)志物[14],血漿中GMP-140含量變化能反映體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)血小板活化程度。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得正常對(duì)照組與血瘀模型組血漿GMP-140含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功。與血瘀模型組比較,血栓心脈寧片低、中、高劑量組均可使急性血瘀模型大鼠血漿GMP-140含量明顯減低,其中以中劑量組效果最為明顯,與陽性對(duì)照組具有相似的效果。血栓心脈寧片對(duì)急性血瘀有良好的防治作用。因中藥的藥物濃度與藥物療效不一定呈線性關(guān)系,當(dāng)超過一定量的最佳藥物濃度后,再增加藥物濃度時(shí),藥物療效未必隨之增加。所以,中劑量組為本實(shí)驗(yàn)的最佳劑量組。
v WF是由血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成的一種糖蛋白,vWF為一種高分子蛋白質(zhì),在血中含量為(5~10)nmol/L。在內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激時(shí)釋放至血漿,v WF可與膠原等結(jié)合而發(fā)生構(gòu)形改變,導(dǎo)致血小板黏附。血漿vWF升高可作為內(nèi)皮細(xì)胞受損的標(biāo)志。它可參與凝血促進(jìn)血小板黏附和聚集,誘發(fā)血栓形成。vWF是反映血管內(nèi)皮受損的一個(gè)指標(biāo),對(duì)判斷血栓形成的危險(xiǎn)及病情輕重有重要的參考價(jià)值[15]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得正常對(duì)照組與血瘀模型組大鼠血漿v WF含量具有顯著差異,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功。血栓心脈寧片低、中、高劑量組均可使急性血瘀模型大鼠血漿vWF含量明顯降低,其中中、高劑量組減低最為顯著,效果與陽性對(duì)照組相似,血栓心脈寧片對(duì)急性血瘀有良好的防治作用。
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