甘露醇對(duì)小鼠腦缺血再灌注后環(huán)氧化酶－2表達(dá)的影響

董寶花，趙嘉訓(xùn)

20%甘露醇注射液作為治療腦水腫、降低顱內(nèi)壓的常用藥在臨床廣泛應(yīng)用，特別是在急救心肺腦復(fù)蘇過程中的治療中尤其重要。目前，關(guān)于甘露醇在心肺腦復(fù)蘇中最佳給藥時(shí)間上沒有給予應(yīng)有的關(guān)注，本課題利用郗東峰等[1]報(bào)道的小鼠腦缺血再灌注損傷模型，于再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)采用甘露醇干預(yù)，觀察其對(duì)小鼠腦海馬CA1區(qū)細(xì)胞內(nèi)環(huán)氧化酶－2（COX－2）表達(dá)情況的影響，從而為臨床救治過程中心肺腦復(fù)蘇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康昆明小鼠36只，體重（35±5）g，雌雄隨機(jī)，清潔級(jí)。本次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為6組，每組6只。假手術(shù)組分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線，但不結(jié)扎；缺血再灌注損傷組分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線結(jié)扎1 h后再灌注，但不給藥；甘露醇即刻干預(yù)組、甘露醇30 min干預(yù)組、甘露醇1 h干預(yù)組、甘露醇1.5 h干預(yù)組分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎1 h后再灌注，分別在再灌注即刻、30 min、1 h和1.5 h尾靜脈注射20%甘露醇1 g/kg。

1.2 主要藥品及試劑 20%甘露醇注射液（石家莊四藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字 H13023007，批號(hào)：090217404），兔多抗COX－2多克隆抗體、生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG、SABC、DAB顯色試劑盒、5%BSA封閉液（武漢博士德公司）。

1.3 模型制備 采用郗東風(fēng)等[1]報(bào)道的昆明小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎腦缺血再灌注損傷模型，造模成功后分別用HE和COX－2免疫組化染色。

1.4 計(jì)算機(jī)圖像分析 用數(shù)碼成像儀在顯微鏡下采集圖片，拍攝圖像，所得圖像采用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像半定量分析，在400倍光學(xué)顯微鏡下，取病灶周圍5個(gè)不重復(fù)高倍鏡視野，測(cè)定細(xì)胞中棕黃色和棕褐色陽(yáng)性表達(dá)顆粒的平均光密度（OD）值，取其平均值作為結(jié)果，越高表示蛋白表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 假手術(shù)組：海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞有層次分明的4～5層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)均質(zhì)紅染，核大而圓，細(xì)胞層向心側(cè)間質(zhì)呈纖維束樣結(jié)構(gòu)，排列整齊。缺血再灌注損傷組：正常錐體細(xì)胞數(shù)明顯減少，可見大量的變性壞死細(xì)胞形成的壞死灶，胞漿內(nèi)有空泡形成。細(xì)胞層排列散亂。細(xì)胞間質(zhì)變性，神經(jīng)索模糊不清。甘露醇即刻干預(yù)組：絕大多數(shù)椎體細(xì)胞保持正常形態(tài)，4層～5層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好。纖維結(jié)構(gòu)清晰可辨。細(xì)胞間可見少數(shù)的固縮、深染的細(xì)胞核，比較A組細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松。甘露醇30 min、1 h、1.5 h干預(yù)組：細(xì)胞層排列散亂。雖然較缺血再灌注損傷組間質(zhì)水腫有所改善，但纖維樣結(jié)構(gòu)凌亂不清晰，并有斷續(xù)現(xiàn)象。變性和壞死細(xì)胞數(shù)較多。

2.2 COX－2在腦組織的表達(dá) 假手術(shù)組幾乎不見海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞表達(dá)COX－2的陽(yáng)性細(xì)胞；缺血再灌注損傷組可見大量棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞；甘露醇干預(yù)組部分血管內(nèi)皮細(xì)胞及海馬區(qū)部分神經(jīng)元表達(dá)COX－2的陽(yáng)性；甘露醇30 min、1 h、1.5 h干預(yù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多，著色加深。

2.3 平均光密度（OD）值 甘露醇即刻干預(yù)組海馬CA1區(qū)平均光密度值低于缺血再灌注組（P＜0.05）；與假手術(shù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；甘露醇30 min、1 h、1.5 h干預(yù)組與缺血再灌注組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組小鼠海馬CA1區(qū)平均光密度值的比較（±s）

表1 各組小鼠海馬CA1區(qū)平均光密度值的比較（±s）

與缺血再灌注組比較，1）P＜0.05

平均光密度值假手術(shù)組組別0.209 5±0.015 6缺血再灌注組 0.326 8±0.024 8甘露醇即刻干預(yù)組 0.213 2±0.010 51）甘露醇30 min干預(yù)組 0.319 3±0.108 4甘露醇1 h干預(yù)組 0.324 8±0.006 8甘露醇1.5 h干預(yù)組 0.324 8±0.004 2

3 討 論

醫(yī)學(xué)急救中腦復(fù)蘇環(huán)節(jié)是保證遠(yuǎn)期復(fù)蘇效果的關(guān)鍵。近年來(lái)腦保護(hù)方法的研究分為缺血前處理[2]和缺血后處理[3]，現(xiàn)階段多數(shù)對(duì)腦缺血再灌注損傷干預(yù)措施的研究集中于缺血再灌注損傷發(fā)生前的預(yù)處理，由于臨床意外難以預(yù)見，預(yù)處理的方法常常無(wú)助于臨床意外腦損傷的救治，因此，近年來(lái)相關(guān)研究越來(lái)越關(guān)注缺血再灌注損傷后的醫(yī)學(xué)救治。鑒于腦缺血再灌注后壞死、凋亡、過氧化物、鈣超載等細(xì)胞病理機(jī)制的不可逆性，醫(yī)學(xué)研究應(yīng)該關(guān)注細(xì)胞的可逆性病理?yè)p害，以組織細(xì)胞水腫變性病變作為觀察對(duì)象更具有現(xiàn)實(shí)意義。

2008年郗東鋒等[1]報(bào)道了昆明小鼠前腦缺血再灌注損害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備方法，該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型與其他同類研究的動(dòng)物模型相比成本低廉，簡(jiǎn)單易行，成功率高，重復(fù)性好，且損傷程度適中，可以通過組織水腫變性病變作為觀察指標(biāo)，獲得腦缺血再灌注損傷救治的相關(guān)研究結(jié)果。2009年王雪紅等[4]和邢春平等[5]分別采用該動(dòng)物模型評(píng)價(jià)了納洛酮和地塞米松的救治效果。2010年郭文義等[6]采用該動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，再灌注即刻甘露醇干預(yù)具有顯著的腦保護(hù)作用，但再灌注30 min以后給予甘露醇基本無(wú)效。

環(huán)氧合酶（COX）是催化花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的限速酶，能引起炎癥反應(yīng)并介導(dǎo)炎癥細(xì)胞毒性。在正常情況下，哺乳動(dòng)物腦內(nèi)不表達(dá)COX－2，在缺血和缺氧引起的炎癥反應(yīng)中，COX－2表達(dá)增高，主要在神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)[7]。COX－2在神經(jīng)組織中的表達(dá)可直接損傷神經(jīng)元，并引起細(xì)胞損傷和腦水腫[8]。

本課題同樣采用郗東鋒等[1]報(bào)道的昆明小鼠前腦缺血再灌注損害實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，觀察缺血再灌注后不同時(shí)間甘露醇干預(yù)對(duì)COX－2表達(dá)的影響。觀察結(jié)果表明，再灌注即刻甘露醇干預(yù)可使小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)，組織結(jié)構(gòu)接近正常，無(wú)間質(zhì)水腫表現(xiàn)，CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞COX－2表達(dá)平均光密度值明顯低于缺血再灌注組（P＜0.05），而與假手術(shù)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明早期應(yīng)用甘露醇建立反相滲透壓梯度，能夠有效對(duì)抗血壓梯度對(duì)組織細(xì)胞水分布的驅(qū)動(dòng)力，可有效防止COX－2的表達(dá)，發(fā)揮腦保護(hù)的作用。但再灌注30 min后給予甘露醇干預(yù)的效果不明顯，且COX－2蛋白表達(dá)增多、光密度值增高，與缺血再灌注對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明甘露醇對(duì)COX－2表達(dá)并無(wú)直接作用。表明再灌注30 min后，一些不可逆的細(xì)胞損害機(jī)制一旦啟動(dòng)，再給予甘露醇救治基本無(wú)效，觀察結(jié)果與郭文義的研究結(jié)果一致。

本研究提示臨床心肺復(fù)蘇救治中在有效血壓梯度建立的同時(shí)應(yīng)該盡快給予甘露醇建立反相的滲透壓梯度，防止腦水腫的發(fā)生，阻斷不可逆細(xì)胞損害機(jī)制的啟動(dòng)。水腫與不可逆細(xì)胞損害機(jī)制之間存在哪些病理鏈接，相關(guān)病理過程的標(biāo)志物及其阻斷方法應(yīng)該成為今后腦缺血再灌注研究的努力方向。

[1] 郗東鋒，郭晉鐸，程周軍，等.小鼠前腦缺血再灌注損傷模型海馬CA1區(qū)的形態(tài)學(xué)觀察[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（3）：197－199.

[2] Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy：Ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats[J].J Cereb Blood Flow Metab，2006，26（9）：1114－1121.

[3] Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：Comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285（2）：H579－H588.

[4] 王雪紅，趙嘉訓(xùn).納洛酮對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元缺血再灌注損傷干預(yù)效果的觀察[J].中國(guó)藥物與臨床，2009，9（11）：1057－1059.

[5] 邢春平，趙嘉訓(xùn).小鼠腦缺血再灌注后地塞米松對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8（2）：196－197.

[6] 郭文義，賀平，薛立超，等.甘露醇對(duì)腦缺血/再灌注損傷后干預(yù)效果評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)研究[J].國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2011，32（6）：647－649.

[7] Nogawa S，Zhang F，Ross ME，et al.Cyclooxygenase－2 gene expression in neurons contributes to ischemic brain damage[J].Neurosc，1997，17（8）：2746.

[8] 劉宏，吳平生.全腦缺血再灌注后發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的機(jī)制[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，1999，19（5）：379.