丹紅注射液對(duì)大鼠腦外傷后AQP4表達(dá)及神經(jīng)元凋亡的影響

王從政，蔡淑芳

水通道蛋白 （aquaporin，AQP）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組與水通透有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中AQP4（Aquaporin4，AQP4）的作用最引人注意，抑制AQP4的表達(dá)可減緩腦水腫的形成，從而降低神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病死率和致殘率[1]。以往認(rèn)為壞死是顱腦損傷神經(jīng)細(xì)胞唯一的死亡方式，近年研究表明腦外傷后神經(jīng)元死亡包括壞死與凋亡兩種方式，神經(jīng)元凋亡在創(chuàng)傷性腦損傷后水腫神經(jīng)元的轉(zhuǎn)歸中占據(jù)重要地位[2]。細(xì)胞壞死不可修復(fù)，人們?cè)噲D通過(guò)對(duì)凋亡途徑的調(diào)控從而更好地改善腦外傷后的預(yù)后，這方面的研究是當(dāng)前顱腦外傷研究的熱點(diǎn)之一。

近年來(lái)，關(guān)于丹紅注射液的腦保護(hù)作用的研究越來(lái)越多，但關(guān)于丹紅注射液對(duì)腦外傷后腦組織中AQP4的表達(dá)及神經(jīng)元凋亡影響的研究較少。為此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠建立腦外傷模型，觀察丹紅注射液對(duì)大鼠腦損傷后AQP4表達(dá)及神經(jīng)元凋亡的影響，以期為腦損傷的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性Wistar大鼠150只（3月齡），清潔級(jí)，體重250 g～300 g，青島市動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（魯）20030010。隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，每組75只，每組又分為傷后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5個(gè)亞組，每個(gè)亞組15只。

1.2 腦損傷模型的建立 大鼠急性腦損傷模型參照Feeney法[3]制作并加以改進(jìn)。打擊器由固定支架、外周套管、打擊墊片和下?lián)袈溴N組成，擊錘重20 g，下落高度為50 cm，落體致傷力20×50（g·cm）。大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后（0.4mL/100 g體重），俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒皮膚，備皮，沿矢狀縫切開(kāi)頭皮，暴露右頂骨，在人字縫前2 mm，矢狀縫右側(cè)2 mm處用牙鉆行顱骨鉆孔并擴(kuò)大成5 mm×5 mm骨窗，保持硬腦膜完整，將直徑5 mm圓墊片放于骨窗處，將大鼠俯臥固定于一已知彈性系數(shù)的海綿床上，移至有機(jī)玻璃管下端 ，墊片正對(duì)有機(jī)玻璃管中央，有機(jī)玻璃管上方置一滑輪，在銅柱上端系一小繩，將滑輪調(diào)整至繩索跨過(guò)滑輪后銅柱處于有機(jī)玻璃管中央為止。待動(dòng)物開(kāi)始蘇醒，有肢體活動(dòng)時(shí)，將銅柱由預(yù)定高度自由墜落于不銹鋼墊片上，立即移開(kāi)海綿床以免再次損傷，下陷深度約2 mm。下落擊錘致右頂葉腦損傷后縫合頭皮。

給藥過(guò)程：治療組大鼠致傷后1 h腹腔內(nèi)注射1.5mL/kg丹紅注射液；對(duì)照組致傷后1 h腹腔內(nèi)注射同體積生理鹽水。

1.3 腦組織取材及處理 在預(yù)定各時(shí)間點(diǎn)，每組取5只大鼠，斷頭取腦后用濾紙蘸凈大腦表面水分，取腦損傷周圍腦組織150 g左右，用電子分析天平稱大腦半球濕重，然后放入110℃烤箱烘烤24 h，再稱干重。每組剩余10只大鼠在預(yù)定各時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.5mL/100 g體重），常規(guī)胸腹聯(lián)合切口，經(jīng)心尖將灌注針插入主動(dòng)脈，依次用生理鹽水500 mL、4℃的4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液500mL灌注固定。斷頭后沿冠狀面提取腦損傷部位前后2 mm組織，后固定2 h，洗滌4 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，貼片后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大腦半球含水量測(cè)定 用干濕重法計(jì)算腦含水量，即腦含水量＝（濕重－干重）/濕重×100%。

1.4.2 HE染色 石蠟切片常規(guī)脫臘至水，蘇木精伊紅染色，光鏡觀察損傷及周邊區(qū)神經(jīng)元形態(tài)。

1.4.3 AQP4表達(dá)免疫組化檢測(cè) 兔抗鼠AQP4多克隆抗體及SABC免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，DAB顯色，光鏡觀察。每只動(dòng)物取三張連續(xù)切片，每張切片高倍鏡下（400倍）隨機(jī)觀察損傷周邊區(qū)不重疊的2個(gè)視野，計(jì)數(shù)AQP4陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)，以個(gè)/高倍鏡視野表示。

1.4.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 原位未端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供，按說(shuō)明書(shū)操作，DAB顯色，光鏡觀察。細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每只動(dòng)物取三張連續(xù)切片，每張切片高倍鏡下（400倍）隨機(jī)選取損傷周邊區(qū)不重疊的2個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)，以個(gè)/高倍鏡視野表示。

2 結(jié) 果

2.1 丹紅注射液對(duì)大鼠腦損傷后腦含水量的影響 與對(duì)照組比較，治療組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量減少，其中在傷后12 h及24 h時(shí)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 丹紅注射液對(duì)大鼠腦損傷后腦含水量的影響（±s） %

表1 丹紅注射液對(duì)大鼠腦損傷后腦含水量的影響（±s） %

與對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

72 h對(duì)照組 80.02±2.35 82.31±1.48 83.86±2.37 83.34±1.3組別 傷后6 h 傷后12 h 傷后24 h 傷后48 h 傷后1 79.41±1.47治療組 76.09±1.191） 77.34±2.352） 78.01±2.212） 80.78±1.431） 77.21±1.391）

2.2 HE染色 對(duì)照組創(chuàng)傷區(qū)細(xì)胞間隙和血管周圍間隙增寬，有神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞壞死、崩解；損傷周圍區(qū)神經(jīng)元胞體明顯腫脹，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞水腫，少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，有大量炎性細(xì)胞滲出，局部可見(jiàn)到炎性細(xì)胞聚集和紅細(xì)胞滲出。在高倍鏡下觀察，損傷周圍區(qū)較多神經(jīng)元外形皺縮，核染色質(zhì)濃縮、深染，核膜境界不清，細(xì)胞間隙增大，呈現(xiàn)典型凋亡細(xì)胞核形態(tài)。提示在創(chuàng)傷中心區(qū)細(xì)胞多表現(xiàn)出壞死，在損傷周圍區(qū)，細(xì)胞多表現(xiàn)為凋亡。丹紅注射液治療組在創(chuàng)傷區(qū)及損傷周圍區(qū)上述病理學(xué)改變明顯減輕，壞死及凋亡細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少。

2.3 AQP4表達(dá)免疫組化檢測(cè) AQP4陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要分布在胞膜，胞質(zhì)和胞核中少見(jiàn)，陽(yáng)性細(xì)胞呈空泡狀，主要位于創(chuàng)傷周邊的水腫區(qū)、創(chuàng)傷側(cè)的皮質(zhì)和血管周圍及白質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞、脈絡(luò)叢、室管膜等處。兩組AQP4陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)見(jiàn)表2。對(duì)照組腦外傷后6 h，AQP4的表達(dá)即開(kāi)始增高，傷后24 h～48 h達(dá)到高峰，至72 h時(shí)已明顯下降。與對(duì)照組比較，治療組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)AQP4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均降低，其中在傷后12 h及24 h時(shí)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 兩組腦損傷后周圍水腫區(qū)AQP4表達(dá)比較（±s） 個(gè)/高倍鏡視野

表2 兩組腦損傷后周圍水腫區(qū)AQP4表達(dá)比較（±s） 個(gè)/高倍鏡視野

與對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

72 h對(duì)照組 27.00±5.88 43.42±5.65 58.88±6.23 41.71±3.4組別 傷后6 h 傷后12 h 傷后24 h 傷后48 h 傷后1 18.83±2.39治療組 21.46±3.411） 34.17±4.742） 40.83±3.172） 36.42±5.541） 15.00±3.801）

2.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 光鏡觀察，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，主要位于打擊灶周邊區(qū)。兩組凋亡神經(jīng)元計(jì)數(shù)見(jiàn)表3，對(duì)照組在傷后6 h即可檢測(cè)到少量凋亡神經(jīng)元，傷后24 h～48 h達(dá)到高峰，而此后凋亡細(xì)胞數(shù)則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。丹紅注射液治療組在上述各時(shí)相點(diǎn)則檢測(cè)到較對(duì)照組明顯減少的凋亡細(xì)胞，在傷后24 h及48 h與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 兩組腦損傷后周圍水腫區(qū)神經(jīng)元凋亡比較（±s） 個(gè)/高倍鏡視野

與對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

72 h對(duì)照組 15.25±5.85 32.75±4.39 39.83±5.61 34.17±3.6組別 傷后6 h 傷后12 h 傷后24 h 傷后48 h 傷后1 21.25±4.17治療組 10.00±3.621） 26.25±3.042） 29.33±4.022） 24.67±5.061） 16.20±4.041）

3 討 論

水通道蛋白是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)膜通道蛋白家族，在介導(dǎo)水跨胞膜的流動(dòng)中起關(guān)鍵作用，在腦內(nèi)分布廣泛，其中AQP4目前被認(rèn)為是介導(dǎo)腦組織中水分子流動(dòng)的最主要的水通道蛋白，成為腦水腫研究的焦點(diǎn)。它的表達(dá)變化對(duì)外傷性腦水腫非常敏感，抑制AQP4可為減輕腦水腫提供新的治療途徑[1]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組造模后腦組織含水量為一動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，在腦外傷后進(jìn)行性發(fā)展，24 h～48 h達(dá)到高峰，然后逐步回落至接近正常。這和臨床上腦外傷患者病情多在2 d內(nèi)惡化相一致。AQP4蛋白的表達(dá)也呈現(xiàn)出這一趨勢(shì)，與腦含水量有明顯的相關(guān)性，這與以前研究的結(jié)論相同[4]。

近幾年，經(jīng)過(guò)一系列的腦外傷動(dòng)物模型及人腦組織標(biāo)本的研究證實(shí)了腦外傷后細(xì)胞凋亡參與了繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展過(guò)程。研究表明，在機(jī)械性腦損傷后早期在外力打擊較嚴(yán)重的中心區(qū)主要表現(xiàn)為細(xì)胞壞死，而在外力打擊相對(duì)較輕的損傷灶周邊部位，傷后一段時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡[5，6]。細(xì)胞壞死不可修復(fù)，人們?cè)噲D通過(guò)對(duì)凋亡途徑的調(diào)控而更好地改善預(yù)后，在外傷性腦損傷中，通常所說(shuō)的腦保護(hù)效應(yīng)，主要是避免神經(jīng)元的遲發(fā)性損傷，以圖打斷病變發(fā)展進(jìn)程，使腦功能受損減到最低程度。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組HE染色及TUNEL染色都表明在損傷灶附近細(xì)胞凋亡是伴隨著細(xì)胞壞死的病理過(guò)程，這兩種不同的死亡過(guò)程共同參與了神經(jīng)元的丟失。

丹紅注射液是丹參和紅花提取物的中藥制劑，臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，丹參可提高抗凝和纖溶功能，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成也有抑制作用，可改善微循環(huán)，清除氧自由基，抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，拮抗鈣離子內(nèi)流，改善ATP酶活性。紅花可以抗凝血，抑制血栓形成，所含的紅花黃色素具有抗氧化作用，可通過(guò)抑制腎素－血管緊張素系統(tǒng)具有降血壓作用[7]，紅花提取物有Ca2＋拮抗作用，可防止腦缺血致神經(jīng)內(nèi)Ca2＋濃度超負(fù)荷而造成的腦損傷。

腦損傷后，病人常出現(xiàn)紅細(xì)胞聚集，血流緩慢以及血漿纖維蛋白原升高等現(xiàn)象[8]。血黏度升高及紅細(xì)胞聚集性增強(qiáng)可使腦血流淤滯，循環(huán)阻力增高，最終導(dǎo)致腦微循環(huán)障礙，腦缺血缺氧，加劇腦水腫和繼發(fā)性腦損壞。丹紅注射液可以通過(guò)改善腦循環(huán)血液流變學(xué)性質(zhì)，增加腦組織血流，糾正缺血缺氧所致的神經(jīng)元代謝紊亂，從而減輕腦水腫和繼發(fā)性腦損害。同時(shí)丹紅注射液具有Ca2＋拮抗作用，抑制神經(jīng)元膜脂質(zhì)過(guò)氧化，維持神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)離子內(nèi)環(huán)境平衡，而發(fā)揮腦保護(hù)作用。最新研究表明[9]丹參能降低腦內(nèi)單胺類、肽類等介質(zhì)代謝紊亂，減輕腦水腫。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控，如bcl－2的表達(dá)降低或bax表達(dá)增多與神經(jīng)細(xì)胞凋亡高度相關(guān)。最近研究證實(shí)丹參注射液可抑制bcl－2表達(dá)降低與bax表達(dá)增多。當(dāng)腦缺血發(fā)生后，丹參能下調(diào)另一細(xì)胞凋亡相關(guān)基因白細(xì)胞介素－1β轉(zhuǎn)化酶（ICE）的表達(dá)，上調(diào)腦缺血后的bcl－2表達(dá)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[9]。

臨床上丹紅注射液常用于冠心病、心絞痛、心肌梗死、瘀血型肺心病、缺血性腦病、腦梗死，腦水腫等心腦血管疾病的治療，對(duì)急性腦梗死患者療效顯著[10]。本實(shí)驗(yàn)中丹紅注射液治療組AQP4表達(dá)較對(duì)照組表達(dá)明顯減少，自傷后6 h～72 h都有不同程度的減少。TUNEL染色也顯示丹紅注射液治療組神經(jīng)元凋亡較對(duì)照組表達(dá)明顯減少。兩組染色都顯示在傷后12 h及24 h時(shí)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明丹紅注射液對(duì)顱腦損傷后腦水腫及神經(jīng)元凋亡有明顯的治療作用，且這一治療作用在傷后12 h至24 h時(shí)最為顯著。本試驗(yàn)結(jié)果提示對(duì)于腦外傷病人有針對(duì)性地使用丹紅注射液對(duì)病人的預(yù)后可能會(huì)有所幫助，但其發(fā)揮腦保護(hù)作用的用藥劑量與時(shí)機(jī)還需要更進(jìn)一步的研究。

[1] Mahley GT，F(xiàn)ujimura M，Ma T，et al.Aquaporin4 deletion in mice redules brain edema after acute water intoxication and in chemic stroke[J].Nat Med，2010，6（2）：159－163.

[2] Rink A，F(xiàn)ung KM，Trojanowski JQ，et al.Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat[J].Am J Path，1995，147（6）：1575－1583.

[3] Feeney DM，Boreson MG，Linnr T，et al.Responses to cortical injury：Methodology and local effects of contusion in the rat[J].Brain Res，1981，211（1）：67－77.

[4] Saadoun S，Papadopoulos MC，Davies DC，et al.Aquaporin4 expression is increased in oedematous human brain tumours[J].Neurol Neurosurg Psychiatry，2008，72（2）：262－265.

[5] Hausmann R，Biermann T，Wiest I，et al.Neuronal apoptosis following human brain injury[J].Int Legal Med，2004，118（1）：32－36.

[6] Wu J，Hua Y，Keep RF，et al.Oxidative brain injury from extravasated erythrocytes after intracerebral hemorrhage[J].Brain Res，2002，95（3）：45－52.

[7] 劉發(fā)，魏苑，楊新中，等.紅花黃素對(duì)高血壓大鼠的降壓作用及對(duì)腎素－血管緊張素的影響[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992，27（10）：785－787.

[8] 腦損傷后血液流變學(xué)改變及丹參治療作用[J].中華神經(jīng)外科雜志，1995，11（1）：26－27.

[9] 傅曉晴，蔡宗葦，黎先春，等.丹參對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理多功能調(diào)治作用的研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，3（21）：373－374.

[10] Kuang PG，Wu Weiping，Li ZZ，et al.Neuroprotective effect of radix salviae miltorrhirae compositive on cerebral ischemia[J].J Trad Med，2009，15（2）：135.