急性腦缺血大鼠鼻腔給予rhEPO治療后腦組織中Ngb 和TNF－α的表達(dá)1）

柴秀琴，郭軍紅

腦血管病的治療一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來(lái)研究表明EPO對(duì)缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[1，2]，且外源性EPO可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入顱內(nèi)[3]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，傳統(tǒng)采用EPO腹腔給藥的方法，其發(fā)揮作用的適宜劑量偏高，且產(chǎn)生多種副反應(yīng)。鼻腔給藥是一種新型的給藥方法，它具有腦靶向性[4]。通過(guò)鼻腔靶向藥物直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的給藥方法，可以使藥物的全身毒性反應(yīng)降低，組織特異性的藥物濃度明顯升高[5]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)腦缺血大鼠小劑量rhEPO鼻腔給藥，通過(guò)測(cè)量腦組織含水量，腦梗死體積，腦組織中腫瘤壞死因子α（TNF－α）和神經(jīng)球蛋白（Ngb）的表達(dá)，證實(shí)rh EPO鼻腔給藥方式的可行性，進(jìn)一步探討rhEPO對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 54只健康雄性SD大鼠，體重250 g～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將其隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、rhEPO治療組，每組18只。每組隨機(jī)選取6只行腦組織含水量測(cè)定，6只行腦梗死體積測(cè)定，6只進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TNF－α與Ngb的表達(dá)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制作 采用Zea－Longa改良線(xiàn)栓法[6]制備大鼠永久性局灶性腦缺血（p MCAO）模型。通過(guò)Longa[6]的5級(jí)4分制評(píng)分法作為模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)。rh EPO治療組在缺血1 h鼻腔給予小劑量rhEPO（48 U/40μL），模型組和對(duì)照組在缺血1 h鼻腔給予等量的生理鹽水。缺血24 h后斷頭處死大鼠，取出完整腦組織。

1.2.2 鼻腔給藥 按照van den Berg等[7]鼻腔給藥的方法。rh EPO治療組大鼠在腦缺血1 h后，將其固定于立體定位架，保持－70°角仰臥，用微量注射器取rhEPO（48 U/40μL），分別將藥液緩慢滴入兩側(cè)鼻孔，不超過(guò)20 min，給藥后保持體位30 min，以避免藥物丟失。對(duì)照組和模型組給予40μL生理鹽水，給藥方法同rhEPO治療組。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定及方法

1.3.1 腦含水量的測(cè)定 采用干、濕重法。大鼠在缺血24 h用10%水合氯醛深麻醉后斷頭處死，取出完整腦組織，切除嗅球、小腦以及腦干，將腦組織沿大腦中線(xiàn)切開(kāi)，取左側(cè)大腦半球，快速在分析天平上稱(chēng)取濕重，然后將其置于100℃烤箱內(nèi)烘24 h后至恒重，再稱(chēng)取其干重，用（濕重－干重）/濕重的百分比來(lái)表示腦組織含水量。

1.3.2 腦梗死體積的測(cè)定 采用TTC染色法。大鼠在缺血24 h用10%水合氯醛深麻醉后斷頭處死，取出完整腦組織，迅速將其置于－20℃冰箱，冷凍20 min后取出，由額極向后均勻切成2 mm厚的冠狀位切片，浸于2%的TTC磷酸鹽緩沖液中，置于37℃的水浴箱中染色30 min，然后在4%的多聚甲醛溶液中固定12 h，取出后用數(shù)碼相機(jī)照相，最后利用圖像分析軟件計(jì)算出每片腦組織梗死區(qū)域的面積，其面積之和乘以腦片厚度即為腦梗死體積。為了消除腦水腫的影響，梗死區(qū)域體積用占對(duì)側(cè)大腦半球體積的百分比來(lái)表示。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 用10%水合氯醛深度麻醉大鼠，剪開(kāi)胸腔暴露心臟，用37℃生理鹽水200 mL經(jīng)心臟灌注，再用4%多聚甲醛300mL灌注固定后斷頭取腦，取視交叉后1 mm～4 mm中段腦組織，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并切片，嚴(yán)格按免疫組化步驟檢測(cè)TNF－α與Ngb的表達(dá)。每只大鼠取相同部位的切片各3張，每張切片在高倍鏡（10×40）下隨機(jī)選取缺血皮層區(qū)域內(nèi)5個(gè)非重疊視野，利用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并取平均值，再計(jì)算各組均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊者采用非參數(shù)Kruskal Wallis檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦含水量測(cè)定（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠腦組織含水量比較（±s） %

表1 各組大鼠腦組織含水量比較（±s） %

與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

腦含水量對(duì)照組組別 n 6 78.54±0.62模型組 6 85.13±0.371）治療組 6 81.25±1.831）2）

2.2 各組大鼠腦梗死體積測(cè)定（見(jiàn)表2） TTC染色結(jié)果顯示，腦組織梗死灶呈白色，正常組織呈紅色。對(duì)照組無(wú)梗死體積。模型組左側(cè)半球梗死灶主要位于額頂葉皮質(zhì)。與模型組相比，rh EPO治療組腦梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（±s） %

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（±s） %

與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

腦梗死體積對(duì)照組組別 n 6 0模型組 6 41.57±1.811）治療組 6 26.81±1.921）2）

2.3 免疫組化方法檢測(cè)Ngb、TNF－α的表達(dá)（見(jiàn)表3） 對(duì)照組腦組織可見(jiàn)少量的表達(dá)，而模型組腦組織可見(jiàn)較多的陽(yáng)性細(xì)胞。與模型組相比，rhEPO治療組TNF－α的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則明顯減少，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ngb，對(duì)照組可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。模型組鏡下可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞和活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。與模型組相比，rhEPO治療組可見(jiàn)較多的血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組大鼠TNF－α的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠TNF－α的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

與對(duì)照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

組別 n TNF－α Ngb 6 7.12±1.38 8.36±1.62模型組 6 29.95±1.941） 21.80±1.091）治療組 6 16.71±1.691）2） 29.73±2.571）2）對(duì)照組

3 討 論

大量的實(shí)驗(yàn)證明EPO對(duì)腦缺血有神經(jīng)保護(hù)作用，其發(fā)揮作用可能與抗炎癥[8]、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡[9]、抗氧化[10]、促進(jìn)血管生成[11]和調(diào)節(jié) NO 的合成[12]有關(guān)。

鼻腔給藥是一種新型的給藥方法，藥物經(jīng)鼻腔進(jìn)入顱內(nèi)主要有三條通路：嗅神經(jīng)通路、嗅黏膜上皮通路和血液循環(huán)通路。前兩種途徑藥物經(jīng)鼻腔直接入顱，嗅神經(jīng)通路是藥物在嗅區(qū)黏膜通過(guò)胞吞或胞飲被嗅神經(jīng)元軸突攝取，經(jīng)過(guò)軸突、神經(jīng)束，再越過(guò)篩板到達(dá)嗅球，最后經(jīng)嗅束進(jìn)入顱內(nèi)。嗅黏膜上皮通路是藥物通過(guò)胞飲、簡(jiǎn)單擴(kuò)散或載體轉(zhuǎn)運(yùn)等方式進(jìn)入嗅神經(jīng)周?chē)闹С旨?xì)胞或細(xì)胞間隙進(jìn)入顱內(nèi)。血液循環(huán)通路途徑是藥物經(jīng)呼吸區(qū)豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)吸收進(jìn)入血液循環(huán)后再通過(guò)血腦屏障入顱。大多數(shù)小分子物質(zhì)是通過(guò)嗅黏膜上皮通路吸收入腦；rh EPO是一種大分子糖蛋白，分子量高，rhEPO鼻腔給藥可能是通過(guò)嗅神經(jīng)通路到達(dá)腦組織。

TNF－α是炎癥反應(yīng)的始發(fā)因子，研究表明其在腦缺血早期的過(guò)度表達(dá)會(huì)加重腦損害的炎癥反應(yīng)，而在損傷修復(fù)階段的低表達(dá)則可以促進(jìn)損傷組織的修復(fù)[13]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組腦組織中可見(jiàn)TNF－α的少量表達(dá)，模型組缺血皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)大量的TNF－α表達(dá)，腦組織的損傷程度與TNF－α的表達(dá)程度平行相關(guān)，腦缺血1 h鼻腔內(nèi)給予rh EPO，24 h后病灶區(qū)TNF－α的表達(dá)下降，腦組織損害減輕，提示鼻腔給予rh EPO可能通過(guò)抑制病灶區(qū)TNF－α的表達(dá)發(fā)揮其抗炎作用。

神經(jīng)球蛋白是由Burmester等[14]德國(guó)科學(xué)家于2000年首先發(fā)現(xiàn)的一種攜氧球蛋白，主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)。體外實(shí)驗(yàn)[15]證實(shí)，在缺血或缺氧條件下，Ngb的表達(dá)上調(diào)，且主要在缺血半暗帶神經(jīng)元中表達(dá)，缺血壞死中心的表達(dá)相對(duì)較低，其在腦組織中發(fā)揮作用可能與其清除NO有關(guān)[16]。EPO可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞中Ngb的表達(dá)[17]。在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組腦組織可見(jiàn)Ngb的表達(dá)，模型組缺血皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)Ngb的表達(dá)增加，腦缺血1 h鼻腔內(nèi)給予rhEPO，可看到rhEPO治療組Ngb的表達(dá)明顯增加，提示鼻腔給予rhEPO可能通過(guò)促進(jìn)Ngb的表達(dá)來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腦缺血大鼠鼻腔給予rhEPO，結(jié)果顯示Ngb的表達(dá)增加，TNF－α的表達(dá)降低，表明rh EPO鼻腔給藥是一種有效的給藥途徑，rhEPO對(duì)腦缺血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而rh EPO鼻腔給藥后是否會(huì)引起鼻黏膜的損傷，是否會(huì)導(dǎo)致誤吸，是否會(huì)因?yàn)閱芸榷绊懡o藥劑量等等，還需進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

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