電針對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能及膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響

王艷艷，李常新，牛小媛

腦梗死（cerebral infarction，CI）具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率，嚴(yán)重危害中老年人身體健康。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AST）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理情況下發(fā)揮重要重要作用，這使其成為臨床治療靶點(diǎn)。既往認(rèn)為AST只對(duì)神經(jīng)元起營(yíng)養(yǎng)作用，近年來(lái)認(rèn)為其在腦梗死后不同階段均發(fā)揮著重要作用。電針（electroacupuncture，EA）對(duì)CI治療作用已被公認(rèn)，但其對(duì)CI后AST的作用研究尚不成熟。膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）在缺血后的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞中尤為明顯，其表達(dá)量的多少可作為研究腦損傷后膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的標(biāo)志[1]。本實(shí)驗(yàn)采用易卒中型腎血管性高血壓大鼠（RHRSP）穩(wěn)定的可以模仿人類(lèi)高血壓腦血管改變的一種動(dòng)物模型，模型復(fù)制后血壓緩慢升高制成MCAO模型可更好模擬臨床腦卒中的發(fā)病情況，其研究對(duì)臨床更有指導(dǎo)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用2月～3月齡，體重80 g～120 g雄性SD大鼠135只（山西省醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。兔抗GFAP抗體、TRITC標(biāo)記的二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；G6805－Ⅱ電針儀為青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；上海產(chǎn)GD350－S型電凝器；SDP－1型大鼠心率血壓計(jì)（中日友好醫(yī)院研制）。

1.2 模型制備及動(dòng)物分組 按已建立的方法復(fù)制RHRSP模型[2]。用SDP－1型大鼠心率血壓計(jì)測(cè)血壓，腎動(dòng)脈狹窄前測(cè)量1次，狹窄后每周測(cè)量1次。腎動(dòng)脈狹窄術(shù)12周內(nèi)死亡5只，剔除5只血壓低于180 mm Hg者，取體重450 g～500 g，血壓≥180 mm Hg且無(wú)腦卒中癥狀和體征的95只大鼠，參照Wahl等[3]的方法，均選取左側(cè)制備 MCAO模型，其中成功制成MCAO模型者90只，另5只MCAO鼠因出血多或手術(shù)顯微鏡下未明確供血是否中斷視為不成功，未入組。余下的30只行相同的開(kāi)顱術(shù)，但不凝閉MCA為（MCAO假手術(shù)組）。MCAO后隨機(jī)分組MCAO假手術(shù)組、MCAO（模型組）、穴位治療組、非穴位治療組，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，后兩組予以電針治療，MCAO后穴位組選病灶對(duì)側(cè)“百會(huì)”、“大椎”用電針儀行電刺激，1次/天，20 min/次，頻率75次/min，電流1 m A～2 m A。非穴位治療組MCAO后在病灶對(duì)側(cè)肢體尾部行電刺激。假手術(shù)組與模型組僅做相同捆綁不予治療。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 根據(jù)Berderson[4]評(píng)分分級(jí)法加以改進(jìn)，觀察其神經(jīng)和行為學(xué)變化。分別于1 d、3 d、7 d、14 d、21 d處死大鼠前觀察其行為表現(xiàn)并進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。

1.3.2 切片制備、病理學(xué)檢查、免疫熒光染色 取經(jīng)梗死灶的腦組織行固定、脫水、浸蠟、包埋及石蠟切片（片厚5μm），行常規(guī)HE染色光鏡下進(jìn)行病理觀察。GFAP免疫熒光染色，病理圖文系統(tǒng)分析。從每張切片選取病灶周?chē)?個(gè)不重疊視野，統(tǒng)計(jì)出每個(gè)視野內(nèi)GFAP的免疫反應(yīng)強(qiáng)度，用平均光密度（OD值）表示。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有的數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析，

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 假手術(shù)組大鼠在各時(shí)段神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0分；各時(shí)間段模型組神經(jīng)功能評(píng)分高于穴位治療組，1 d時(shí)兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3 d、7 d、14 d、21 d，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。3 d時(shí)模型組大鼠神經(jīng)缺損癥狀最重，而電針組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其神經(jīng)功能缺損評(píng)分在逐漸降低。在各時(shí)間點(diǎn)模型組與非穴位組無(wú)明顯差異。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（±s） 分

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（±s） 分

與同時(shí)段假手術(shù)組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與同時(shí)段模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

組別 n 6 0 0 0 0 0模型組 6 3.99±0.502） 5.01±0.752） 3.18±1.072） 2.13±0.522） 1.38±0.382）非穴位組 6 3.83±0.702） 4.96±0.432） 3.23±1.022） 2.22±0.622） 1.33±0.302）穴位治療 6 3.32±0.662） 2.83±0.461）4） 1.56±0.361）4） 1.05±0.482）3） 0.66±0.782）3）1 d 3 d 7 d 14 d 21 d假手術(shù)組

2.2 HE染色病理觀察 1 d～3 d模型組主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞壞死征象。7 d模型組和電針組可見(jiàn)腦軟化灶，灶內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。14 d模型組腫脹減輕，病灶中心組織有壞死、脫落。21 d模型組和電針組鏡界清楚，神經(jīng)細(xì)胞排列有序，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死不明顯，細(xì)胞輪廓及核仁較清晰。非穴位治療組各時(shí)間點(diǎn)病理改變與同時(shí)間點(diǎn)模型組無(wú)明顯差異。

2.3 GFAP免疫熒光染色 熒光顯微鏡下見(jiàn)，腦缺血7 d時(shí)，各組大鼠腦梗死病灶周?chē)梢?jiàn)到AST的活化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞胞體肥大，突起增多。14 d時(shí)，AST活化更加明顯。在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)模型組和電針組GFAP表達(dá)都明顯增高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），電針組GFAP表達(dá)均明顯低于同時(shí)段模型組（P＜0.05）。各時(shí)間點(diǎn)模型組GFAP表達(dá)與非穴位組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腦缺血灶周?chē)鷧^(qū)GFAP激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠腦缺血灶周?chē)鷧^(qū)GFAP激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)結(jié)果（±s）

與同時(shí)段假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與同時(shí)段模型組比較，2）P＜0.01

組別 n 6±4.51 529.22±4.90模型組 6 716.36±8.881） 620.07±12.091） 792.24±7.811） 794.32±8.801） 600.58±7.341）非穴位組 6 715.74±8.141） 618.88±8.211） 789.97±8.061） 791.88±7.651） 598.61±4.861）穴位治療 6 689.31±11.941）2） 598.92±11.711）2） 758.31±7.341）2） 761.47±8.961）2） 584.54±7.771）2）1 d 3 d 7 d 14 d 21 d假手術(shù)組 6 542.36±7.03 534.35±6.07 526.53±3.94 528.3

3 討 論

有學(xué)者認(rèn)為CI損傷觸發(fā)了細(xì)胞和分子修復(fù)機(jī)制，其中包括保護(hù)機(jī)制和神經(jīng)發(fā)生的激活。以往AST僅被視為具有固定腦細(xì)胞的功能，目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AST能調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸的合成和生長(zhǎng)，和血管互相作用形成膠質(zhì)血管網(wǎng)絡(luò)，不但構(gòu)成腦的結(jié)構(gòu)，而且是激動(dòng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)交流的區(qū)域，膠質(zhì)血管單位根據(jù)膠質(zhì)細(xì)胞的協(xié)調(diào)信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng)[5]，并且AST可誘導(dǎo)成年神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)發(fā)生。AST在諸多方面發(fā)揮重要作用，干預(yù)腦缺血后腦組織中AST的表達(dá)也許可以成為一個(gè)新的治療方向。

CI后出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損體征，在局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭校Ｓ玫脑u(píng)價(jià)缺血損傷的方法有神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)和形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)按照改進(jìn)的Berderson評(píng)分分級(jí)法進(jìn)行評(píng)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為0～12分更詳細(xì)，客觀性更強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果顯示，不同時(shí)段的模型組與假手術(shù)組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大鼠造模后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)缺損體征，表明腦缺血模型造模成功。同一時(shí)段的電針組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明電針可降低大鼠腦梗死神經(jīng)功能缺損評(píng)分，進(jìn)而改善神經(jīng)功能。

是什么促進(jìn)穴位電針治療神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低，已有研究發(fā)現(xiàn)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的增加有助于大鼠在水迷宮測(cè)試中行為參數(shù)的變化，AST的活化可能介導(dǎo)了腦缺血大鼠的功能恢復(fù)。GFAP是AST的特征性蛋白，在缺血性腦損傷早期梗死毗鄰區(qū)GFAP表達(dá)迅速增高[6]。既往的研究表明，GFAP反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞肥大和增生在神經(jīng)元損傷修復(fù)方面具有重要作用。而近年關(guān)于電針調(diào)節(jié)AST活化狀態(tài)的研究也頗多。甘云波等[7]發(fā)現(xiàn)針刺可抑制膠質(zhì)增生，從而有可能為神經(jīng)再生和功能重建提供更有利的生存環(huán)境。王黎等[8]認(rèn)為電針能明顯減輕或抑制缺血的大鼠海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損害。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：在MCAO后1 d、3 d、7 d、14 d及21 d時(shí)，模型組和電針穴位組GFAP的表達(dá)都明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。而電針組GFAP的表達(dá)均明顯低于同時(shí)段模型組（P＜0.01）。說(shuō)明電針抑制腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增殖活化，從而可能下調(diào)了星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后的一系列損傷反應(yīng)，更有利于發(fā)揮星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)效應(yīng)，從而有利于缺血損傷的修復(fù)，本實(shí)驗(yàn)神經(jīng)功能改善是電針影響AST表達(dá)機(jī)制之一。

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