中藥復(fù)方冠心康對大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞Bcl－2、Bax 表達(dá)的影響1）

邱少波，梁 燕，劉 萍

隨著人口老齡化，冠心病的發(fā)病率和死亡率逐年增高，雖然通過溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)等各種心肌保護(hù)技術(shù)，降低了死亡率，但心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）仍無法完全避免。而心肌細(xì)胞凋亡是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展中重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，大量研究表明，在眾多心臟疾病中如心力衰竭、心律失常、心肌病、心肌梗死等都有心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[1]。大量的動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡與MIRI有著密切關(guān)系，且凋亡在心肌細(xì)胞再灌注過程中起著關(guān)鍵作用[2]。中藥復(fù)方冠心康具有抗心肌缺血和緩解心絞痛的作用[3]，并能顯著縮短豚鼠模擬缺血早期和再灌注早期心肌90%動作電位時程[4]，在此研究基礎(chǔ)上，本實驗采用大鼠 MIRI模型，觀察中藥復(fù)方冠心康對大鼠MIRI心肌細(xì)胞凋亡因子Bcl－2、Bax表達(dá)的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠，體重200 g～250 g，共40只，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號SYXK（滬）2010－0095。所有動物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院SPF級動物實驗中心。

1.2 實驗藥物 冠心康由黃芪、全瓜蔞、薤白、益母草、丹參、制半夏組成，均購于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科，并煎成湯劑。鹽酸地爾硫卓片（恬爾心），浙江亞太藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號20110303。

1.3 主要試劑 Bcl－2、Bax多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，En Vision試劑（HRP/Rabbit）即用型丹麥Dako公司產(chǎn)品，Tunel試劑盒、蘇木素－伊紅均購自南京建成科技有限公司，3%戊巴比妥鈉、10%甲醛溶液等均為上海威奧生物科技有限公司提供。

1.4 主要儀器 小動物呼吸機：上海奧爾科特技術(shù)有限公司；多導(dǎo)電生理儀：Power Lab生物信號采集分析系統(tǒng)為澳大利亞埃德儀器國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；切片機：德國Lico公司產(chǎn)品，型號：RM2145；微波爐：格蘭仕 WD800SL－4Ⅱ；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GNP－9270上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電熱恒溫水浴鍋：DK－S22上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.5 實驗分組 隨機分為4組：假手術(shù)組、MIRI模型組、冠心康組、鹽酸地爾硫卓組。

1.6 給藥時間和方法 術(shù)前灌胃7 d，每日灌胃1次。冠心康按生藥13 g/（kg·d）灌胃給藥。鹽酸地爾硫卓按30 g/（kg·d）灌胃給藥。假手術(shù)組和MIRI模型組分別于相同時間給予等容積的生理鹽水灌胃。

1.7 動物模型的建立及評價 于末次給藥1 h后，通過結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支30 min，再灌注2 h，制備大鼠MIRI模型，以往已有實驗證實此缺血再灌注時間足以引起心肌細(xì)胞凋亡[5，6]。

將大鼠稱重量，3%戊巴比妥鈉，0.15mL/100 g，經(jīng)腹腔注射麻醉后，仰臥固定。氣管插管，連接小動物呼吸機，呼吸頻率70次/min～80次/min，潮氣量8 mL～12 mL，呼吸氣比為1∶2，呼吸壓力1.5 k Pa～2.5 k Pa，同時用多導(dǎo)電生理儀Ⅱ?qū)?lián)記錄心電圖。胸部脫毛，在心臟搏動最明顯處鈍性分離肌肉開胸，鈍性分離第3、4肋骨間肌肉，用眼科開瞼器打開視野，剪開胸膜、心包膜，充分暴露心臟。在左心耳下（相當(dāng)于肺動脈圓錐與左心耳之間，距主動脈根部2.5 mm～3 mm處），用4－0帶線縫合針線穿過一小束心肌，將硅膠管置于結(jié)扎線與血管之間，拉緊結(jié)扎線，使硅膠管壓迫冠狀動脈左前降支而至閉塞，亦便于切斷結(jié)扎線再通。結(jié)扎后左室壁局部變蒼白，心電圖出現(xiàn)QRS波群變寬大畸形者為結(jié)扎成功。缺血30 min后，松解結(jié)扎線實現(xiàn)冠脈再灌注。再灌注后，可見左室壁蒼白部分逐漸紅潤，心電圖上寬大畸形的QRS波群變窄，波幅下降，提示再灌注成功。假手術(shù)組同樣手術(shù)但不結(jié)扎冠脈。

1.8 取材及檢測指標(biāo) 造模成功后，將大鼠處死，剪取心臟，生理鹽水沖洗，在MIRI區(qū)域取材，作為組織標(biāo)本。用10%甲醛液固定12 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，檢測指標(biāo)如下。

1.8.1 心肌組織病理學(xué) 切片厚度為4μm，常規(guī)蘇木素－伊紅（HE）染色。

1.8.2 心肌細(xì)胞凋亡的原位標(biāo)記檢測 采用TUNEL法并嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。每張切片隨機選擇5個非重疊視野（400倍），計數(shù)陽性染色的心肌細(xì)胞數(shù)及心肌細(xì)胞總數(shù)，計算細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），AI＝陽性細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8.3 免疫組化檢測Bcl－2、Bax的表達(dá) 按照En Vision法進(jìn)行免疫組化檢測，簡要步驟為：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS沖洗3 min×3次，用p H6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液熱誘導(dǎo)修復(fù)（微波3檔，20 min），然后室溫自然冷卻，PBS沖洗3 min×3次，經(jīng)0.3%H2O2室溫下20 min后，PBS沖洗3 min×3次，后經(jīng)20%正常羊血清室溫孵育30 min，滴加一抗Bcl－2或Bax后37℃孵育2 h，PBS沖洗3 min×3次，之后用En Vision試劑37℃30 min，PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色8 min～12 min，蘇木素染色，熱水藍(lán)化，在顯微鏡250倍下用圖形分析系統(tǒng)定量觀察。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織病理學(xué)改變 HE染色（光學(xué)顯微鏡×200倍）：假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核居中，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞著色均勻；MIRI模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，部分區(qū)域有斷裂，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞著色不均勻，區(qū)域性水腫變性明顯；冠心康組心肌細(xì)胞排列基本整齊，細(xì)胞著色相對均勻，水腫變性不明顯；鹽酸地爾硫卓組心肌細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞著色不均勻，水腫變性稍明顯。

2.2 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 光鏡下觀察，心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，而心肌凋亡陽性細(xì)胞的細(xì)胞核為深淺不一的棕褐色。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，MIRI模型組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)值顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與 MIRI模型組比較，冠心康組和鹽酸地爾硫卓組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s） %

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s） %

與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與 MIRI模型組比較，2）P＜0.01

組別 n 10 9.8±2.7 MIRI模型組 10 31.5±7.81）鹽酸地爾硫卓組 10 14.9±5.62）冠心康組 10 12.3±2.32）凋亡指數(shù)假手術(shù)組

2.3 心肌細(xì)胞凋亡因子Bcl－2、Bax的表達(dá) 抑制凋亡因子Bcl－2在MIRI后表達(dá)明顯降低，冠心康組和鹽酸地爾硫卓組表達(dá)則明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而促凋亡因子Bax在MIRI后表達(dá)明顯升高，冠心康組和鹽酸地爾硫卓組表達(dá)則明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組心肌組織中Bcl－2、Bax的表達(dá)（±s） μm2

表2 各組心肌組織中Bcl－2、Bax的表達(dá)（±s） μm2

與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與 MIRI模型組比較，2）P＜0.01

Bcl－2 Bax假手術(shù)組 10 292 007.7±32 530.3 86 718.9±9 927.5組別 n MIRI模型組 10 184 933.5±17 160.71）190 052.4±52 243.71）鹽酸地爾硫卓組 10 260 398.0±39 590.82）100 477.3±13 751.32）冠心康組 10 280 428.2±40 493.02） 92 511.0±15 950.92）

3 討 論

MIRI可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死，同時也可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。1994年Gottlieb等[7]首先在兔心臟上發(fā)現(xiàn)再灌注損傷促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。隨著分子心臟病學(xué)研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控在MIRI的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。

目前研究的凋亡調(diào)控基因主要為Bcl－2家族、Caspase家族、細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子、p53等。其中Bcl－2基因家族是心肌細(xì)胞凋亡過程中極其重要的調(diào)節(jié)因子[8]。Bcl－2家族蛋白根據(jù)其功能主要分為兩大類：抑細(xì)胞凋亡因子，以Bcl－2、Bcl－x L為代表；促細(xì)胞凋亡因子，以Bax、Bad、Bak、Bid為代表。Bcl－2基因家族成員自身或與Bax彼此之間可形成二聚體或多聚體，通過蛋白－蛋白相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活或凋亡。Bcl－2蛋白主要定位于線粒體外膜，起抑制凋亡的作用。而具有促凋亡作用的Bax蛋白則主要定位細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡因子的誘導(dǎo)，便向線粒體轉(zhuǎn)位。Bcl－2和Bax相互競爭，間接調(diào)節(jié)蛋白酶和核酸酶活性，從而雙相調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax表達(dá)占優(yōu)勢時促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl－2表達(dá)占優(yōu)勢時則阻止細(xì)胞凋亡，因此有學(xué)者將 Bcl－2和 Bax稱為心肌細(xì)胞的“死亡開關(guān)”[9，10]。

冠心病在祖國醫(yī)學(xué)中屬于“胸痹”范疇，責(zé)之于本虛標(biāo)實。MIRI是冠心病的一個病理環(huán)節(jié)，常見臨床表現(xiàn)主要為胸痛、胸悶、短氣、乏力等。中醫(yī)病機以氣虛痰濁血瘀多見。中藥復(fù)方冠心康以《金匱要略》中栝樓薤白半夏湯為基礎(chǔ)加減化裁而成。全方以黃芪為君，丹參、益母草為臣，補氣生血、活血祛瘀；佐以全瓜蔞、薤白、半夏，燥濕化痰、通陽解穢。前期研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯的調(diào)脂、抗心肌缺血、緩解心絞痛的作用，深入研究發(fā)現(xiàn)本方可進(jìn)一步開放離體大鼠MIRI心肌KATP通道，可明顯增加Ca2＋－Mg2＋－ATP酶、Na＋－K＋－ATP酶活性，抑制 Ca2＋超載、減輕Ca2＋內(nèi)流；能夠明顯促進(jìn)超氧化物歧化酶（SOD）的產(chǎn)生，有效清除氧自由基作用[11，12]。本實驗采用大鼠 MIRI模型，發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方冠心康組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低，同時，抑凋亡因子Bcl－2的表達(dá)明顯升高，而促凋亡因子Bax的表達(dá)則明顯降低。

綜上所述，中藥復(fù)方冠心康可明顯減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，其作用機制是通過調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡基因而發(fā)揮保護(hù)作用，但是，中藥復(fù)方的作用機制是多靶點的，是否還通過其他機制起到保護(hù)作用，仍需要進(jìn)一步深入探討研究。

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