黃芪甲苷對(duì)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞體外血管生成能力的影響

沈 藝，謝南姿

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類(lèi)能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，也未形成血管的前體細(xì)胞[1]。有研究顯示，EPCs不僅參與人胚胎血管生成，同時(shí)也參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過(guò)程[2]。目前，EPCs介導(dǎo)的治療性血管再生及損傷血管修復(fù)已經(jīng)成為心血管疾病治療的研究熱點(diǎn)之一。血管生成能力是EPCs最重要的功能之一。黃芪甲苷（astragalosideⅣ）也稱(chēng)黃芪皂苷甲、黃芪皂苷Ⅳ，是從中藥黃芪中分離得到的一種具有多種藥理活性的皂苷類(lèi)化合物，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、保護(hù)組織器官、降低血糖、抗細(xì)胞凋亡和抗炎、抗病毒等多方面的藥理作用。有研究表明，黃芪甲苷可減少心肌細(xì)胞損傷和阻止內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[3]。本研究主要觀察黃芪甲苷對(duì)體外培養(yǎng)外周血EPCs血管生成能力的影響，探討其可能的血管保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 FITC標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ（FITC－UEA－Ⅰ）購(gòu)自Sigma公司；DiI標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI－acLDL）、人纖維連接蛋白（HFN）購(gòu)自Chemicon公司；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）購(gòu)自Peprotech公司；FITC標(biāo)記抗CD34抗體、抗CD133抗體和KDR購(gòu)自BD公司；DETA－NO購(gòu)自Molecular Probe公司；M199、胎牛血清購(gòu)自Hyclone；1∶250胰蛋白酶購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，進(jìn)口分裝；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆惑w外血管形成試劑盒（Sigma公司）；黃芪甲苷（上海融禾公司）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs分離 取外周血10mL，肝素抗凝，采用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，接種在24孔板上。應(yīng)用M199培養(yǎng)基（含20%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL）培養(yǎng)，每3 d～4 d換液，去除非貼壁細(xì)胞。換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至7 d，PBS液去除非貼壁細(xì)胞，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.2.2 EPCs細(xì)胞鑒定 獲取的外周血單個(gè)核細(xì)胞，以2×106/mL～3×106/mL接種在纖連蛋白包被24孔板及6孔板，培養(yǎng)第4天取出，將細(xì)胞與2.4 ng/mL的DiI－ac LDL在37℃溫度下孵育1 h，以檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)DiI－acLDL的攝取。采用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。應(yīng)用PBS清洗2 min，將10 ng/mL的FITC－UEA－I加于上述標(biāo)本，在37℃溫度下孵育1 h。采用激光共聚焦顯微鏡鑒定DiI－ac LDL和UEA－I雙染色陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞。倒置熒光顯微鏡對(duì)每孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨機(jī)選擇15個(gè)隨機(jī)顯微鏡視野（×400倍）的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)志[4]。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 培養(yǎng)4 d后，收集貼壁細(xì)胞并隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組（A組），黃芪甲苷低（1 0μg/mL）、中（2 0 μg/mL）、高（40μg/mL）劑量干預(yù)組（B組、C組、D組）。培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行細(xì)胞功能檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞集落、梭形細(xì)胞計(jì)數(shù) 用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)15個(gè)隨機(jī)顯微鏡視野（×200倍）的梭型細(xì)胞數(shù)目。培養(yǎng)第7天，用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)15個(gè)隨機(jī)顯微鏡視野（×200倍）細(xì)胞集落。

1.2.5 EPCs黏附能力檢測(cè) 用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，懸浮在500μL培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，然后將同等數(shù)目的EPCs鋪在24孔板，在37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)1 h后，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。不同濃度羅格列酮共培養(yǎng)48 h后，將同等數(shù)目的EPCs接種在包被有人纖維連接蛋白培養(yǎng)板，在37℃下培養(yǎng)30 min，計(jì)數(shù)15個(gè)隨機(jī)200倍視野中貼壁細(xì)胞[4]。

1.2.6 EPCs遷移能力檢測(cè) 將200μL培養(yǎng)液和50 ng/mL的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）20μL，加入改良的Boyden小室的下室，將2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞懸浮在100μL培養(yǎng)液注入上室，在37℃5%二氧化碳孵箱培養(yǎng)6 h，取出微孔濾膜，PBS漂洗，以無(wú)水乙醇固定，Harris蘇木精染色，在37℃溫度下烤膜過(guò)夜，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明濾膜。對(duì)遷移到低層的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，選擇3個(gè)隨機(jī)顯微鏡視野（×400倍）進(jìn)行計(jì)數(shù)[4]。

1.2.7 EPCs增殖能力的檢測(cè) 培養(yǎng)4 d后，0.25%胰蛋白酶消化搜集貼壁細(xì)胞，500μL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)，再將等量EPCs接種到包被有人纖維連接蛋白96孔培養(yǎng)板，同時(shí)加入雌二醇使其終濃度為0.001μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L，培養(yǎng)48 h，加入MTT，6 h后吸棄上清液，加入DMSO，于微量振蕩器充分振蕩10 min，波長(zhǎng)562 nm處測(cè)吸光度值[4]。

1.2.8 EPCs血管生成能力的檢測(cè) 采用體外血管生成試劑盒檢測(cè)體外內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管生成能力。200倍倒置顯微鏡下觀察?。ㄑ┕苌汕闆r。選擇200倍光鏡下5個(gè)視野，計(jì)數(shù)小管數(shù)。細(xì)胞拉長(zhǎng)變形，長(zhǎng)度為寬度的4倍以上即可被認(rèn)為形成小管。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及鑒定 細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示，剛分離的細(xì)胞呈圓形不貼壁，4 d可以觀察到橢圓形、短梭形細(xì)胞；培養(yǎng)第7天，梭形細(xì)胞逐漸增多。

外周血獲取的單個(gè)核細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)7 d后對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)7 d用FITC－UEA－I和DiI－ac LDL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。通過(guò)共聚焦顯微鏡，DiI－ac LDL、FITC－UEA－I雙染色陽(yáng)性細(xì)胞（呈黃色）被認(rèn)為是正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞。

外周血獲取的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，其中表達(dá)CD133（18.73±7.12）%，CD34（32.15±8.68）%，KDR（69.45±8.21）%，進(jìn)一步證明獲得的細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。

2.2 不同濃度黃芪甲苷對(duì)體外培養(yǎng)EPCs生物學(xué)功能的影響（見(jiàn)表1）

表1 各組EPCs數(shù)量、增殖、遷移、黏附及血管生成功能的比較（±s）

表1 各組EPCs數(shù)量、增殖、遷移、黏附及血管生成功能的比較（±s）

與A組比較，1）P＜0.05；與B組比較，2）P＜0.05

血管生成組別 數(shù)量cells×200增殖OD值遷移cells×400黏附cells×200 59±9 0.45±0.08 12±4 28±7 21±5 B組 87±121） 0.65±0.091） 20±61） 41±81） 42±71）C組 101±151）2） 0.81±0.091）2） 29±51）2） 58±101）2） 55±111）2）D組 105±131）2） 0.67±0.081） 26±71） 46±71） 42±71）cells×200 A組

3 討 論

血管內(nèi)皮的損傷和修復(fù)保持著動(dòng)態(tài)平衡，維持血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能的完整。血管內(nèi)膜輕微受損，通過(guò)鄰近內(nèi)皮細(xì)胞增殖來(lái)修復(fù)，而強(qiáng)烈內(nèi)膜損害要通過(guò)循環(huán)中血管內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢到損傷部位來(lái)修復(fù)。器官與組織的血管新生主要通過(guò)血管形成（angiogenesis）和血管生成（vasculogenesis）兩種機(jī)制。血管形成是指內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，以出芽或套迭的方式，從已存在的血管床中長(zhǎng)出，形成新的血管；血管生成是由血管內(nèi)皮祖細(xì)胞原位分化、聚集，形成血管。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，血管形成在胚胎及成體都存在，而血管生成僅限于胚胎發(fā)育階段。1997年，Asahara等[1]首次分離并證實(shí)成年大鼠骨髓中存在著能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的EPCs，并在體內(nèi)證實(shí)了其生成血管的能力。來(lái)源于骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、趨化、分化，參與新生血管的形成，更新了傳統(tǒng)意義上的出生后血管生成、血管損傷修復(fù)理論，并為血管再生相關(guān)性疾病的研究治療提供了新思路。有研究證實(shí)，EPCs不僅參與胚胎時(shí)期的血管生成，同時(shí)也參與出生后血管新生及受損血管內(nèi)皮再生[5]，隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，EPCs介導(dǎo)的治療性血管新生及損傷血管修復(fù)正逐漸成為心血管研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。目前，通過(guò)各種途徑向體內(nèi)移植或動(dòng)員機(jī)體自身的EPCs可以促進(jìn)損傷血管內(nèi)膜的再內(nèi)皮化、抑制內(nèi)膜的超常增生、提高缺血組織的血管再生能力[6]。研究顯示，他汀類(lèi)藥物、雌激素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1（SDF－1）均具有動(dòng)員骨髓 EPCs，修復(fù)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的能力[7，8]。黃芪中的主要活性成分為黃芪皂苷、黃芪多糖（astragalus polysaccharides）和黃芪異黃酮（isoflavones），目前主要采用黃芪皂苷中的黃芪甲苷作為評(píng)價(jià)黃芪藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)[9]。有研究表明，黃芪甲苷具有清除氧自由基，抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用[10]。黃芪甲苷能夠減輕急性高糖引起的人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮屏障功能的損傷，抑制內(nèi)皮電阻抗下降及單層內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的增大[11]。黃芪甲苷通過(guò)抑制缺氧復(fù)氧引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（NFκB）表達(dá)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附，對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，且呈劑量依賴(lài)性[12]。有研究亦發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可降低高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖，而且可降低高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，并且升高了的血管平滑肌細(xì)胞的增殖指數(shù)也被降低，并呈劑量依賴(lài)性[13]。本研究通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)EPCs應(yīng)用不同濃度黃芪甲苷干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可增加體外培養(yǎng)EPCs數(shù)量，能夠改善EPCs的增殖、黏附、遷移及體外血管生成能力，其作用效果在20μg/mL時(shí)最明顯。

[1] Asahara T，Murobara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science，1997，275：964－967.

[2] Mihail H，Christian W.Endothelial progenitor cells in vascular repair and remodeling[J].Pharmacological Research，2008，58（2）：148－151.

[3] 李香華，王洪新.黃芪甲苷在心血管疾病中的作用[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2011，32（1）：132.

[4] 郭偉新，楊期東，謝曉云，等.頸動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞部分生物學(xué)功能改變及其意義[J].腦與神經(jīng)疾病雜志，2008，16（1）：32－35.

[5] Atsuhiko K，Masaaki I，Takayuki A.Vascular regeneration：Endothelial progenitor cell therapy for ischemic diseases[J].Regenerative Medicine，2011，34：731－734.

[6] 劉峰，雷閩湘，謝曉云.初發(fā)2型糖尿病患者早期內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的變化及其意義[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009（8）：1－5.

[7] 馬駿，姜萌，何奔.他汀類(lèi)藥物對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的相關(guān)作用[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011（6）：1115－1118.

[8] Alexandros B，Dimitris T，Charalambos A，et al.The role of endothelial progenitor cells in vascular repair after arterial injury and atherosclerotic plaque development[J].Cardiovascular Therapeutics，2011，29（2）：125－139.

[9] 段立軍，孫博航.黃芪甲苷的研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（5）：410－416.

[10] 高衛(wèi)真，康毅，婁建石，等.黃芪苷Ⅳ對(duì)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)心血管雜志，2005，10（3）：166－169.

[11] Li HB，Ge YK，Zhang L，et al.Astragaloside IV improved barrier dysfunction induced by acute high glucose in human umbilical vein endothelial cells[J].Life Sci，2006，79（12）：1186－1193.

[12] 楊富國(guó)，劉革新，董果雄，等.黃芪甲苷對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附能力及細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB表達(dá)的影響[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（15）：2843－2846.

[13] Yuan W，Zhang Y，Ge Y，et al.Astragaloside IV inhibits proliferation and promotes apoptosis in rat vascular smooth muscle cells under high glucose concentration in vitro[J].Planta Med，2008，74（10）：1259－1264.