替羅非班早期干預(yù)對非ST抬高型急性冠脈綜合征患者MMP－9與sCD40L 表達的影響

張利峰，王光輝，張俊芳，王桂東

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是危害人類健康的常見心血管疾病，是引起死亡的主要原因之一，目前認為AS是一種炎癥性疾病，其發(fā)生、發(fā)展的各個階段符合慢性炎癥的表現(xiàn)[1]。近年來CD40和CD40配體（CD40ligand，CD40L）在AS發(fā)生和斑塊穩(wěn)定性中的作用日益引起人們的重視。急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）有共同的病理生理，即冠狀動脈粥樣斑塊破裂，形成血栓，使冠狀動脈血管部分或完全閉塞，導(dǎo)致心肌缺血或梗死。而血小板的活化、黏附和聚集是動脈血栓形成過程中的關(guān)鍵步驟。激活的血小板釋放的可溶性CD40配體（sCD40L）對研究ACS的發(fā)生、發(fā)展具有重要價值[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一種依賴Zn2＋和Ca2＋的酶家族，能特異性地與細胞外基質(zhì)各成分相結(jié)合，并降解胞外基質(zhì)。MMPs的活性與斑塊不穩(wěn)定性密切相關(guān)，其中以基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）關(guān)系最為密切[3，4]。

本研究選擇非ST抬高型急性冠脈綜合征患者，采用替羅非班干預(yù)，觀察對MMP－9、可溶性CD40配體（sCD40L）的影響，進一步探討替羅非班對斑塊穩(wěn)定性和抑制免疫炎癥的可能機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2011年1月—2011年5月本院心內(nèi)科ACS患者120例，其中男60例，女60例，年齡42歲～75歲。全部病例達到不穩(wěn)定型心絞痛或非ST段抬高型急性心肌梗死診斷標準，并且TIMI評分在3分以上為入選標準。排除各種急慢性感染性疾病、糖尿病酮癥、腎臟、肝臟疾患、Graves病、肺間質(zhì)纖維化、結(jié)締組織病及腫瘤、外周血管病和腦血管病。將上述患者隨機分為常規(guī)治療組與替羅非班組，年齡分別為（55.1±8.9）歲、（52.5±9.8）歲，差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 全部病例行常規(guī)治療，包括抗血小板、抗凝、擴冠治療；常規(guī)治療未應(yīng)用替羅非班，替羅非班組加用替羅非班（欣維寧，武漢遠大制藥），用量根據(jù)體重計算，起始推注劑量為10μg/kg，在3 min內(nèi)推注完畢，而后以0.15μg/（kg·min）的速率維持滴注，維持量滴注持續(xù)36 h。

1.2.2 檢測方法 常規(guī)治療組次日清晨抽血，應(yīng)用替羅非班組12 h、24 h、36 h分別抽取患者血液標本3mL，立即注入預(yù)先加有無菌3.8%枸櫞酸鈉0.2mL的抗凝管中備用。分離血單一核細胞：按文獻[5]進行。按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，將RNA在－70℃保存待測[6]。然后進行逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)，紫外凝膠圖像分析儀進行數(shù)據(jù)分析，以目的基因mRNA擴增后產(chǎn)物的光密度值與內(nèi)參照GAPDHmRNA擴增后產(chǎn)物光密度值的比值作為mRNA表達的相對值。sCD40L、MMP－9及內(nèi)參GADPH的引物序列見表1。

表1 MMP－9和sCD40L的引物序列

2 結(jié) 果

替羅非班同時抑制MMP－9與sCD40L的表達，其作用亦呈時間依賴性。與常規(guī)治療相比，應(yīng)用替羅非班后12 h、24 h、36 h MMP－9的表達降低50%、73%和82%；sCD40L的表達降低32%、69%和88%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 替羅非班對MMP－9、sCD40L表達的影響（±s）

表2 替羅非班對MMP－9、sCD40L表達的影響（±s）

與常規(guī)治療相比，1）P＜0.05

MMP－9m RNA sCD40LmRNA常規(guī)治療組 1.146±0.006 1.312±0.017組別替羅非班組12 h 0.878±0.0951） 1.118±0.0271）24 h 0.704±0.0131） 0.702±0.0221）36 h 0.502±0.0071） 0.492±0.0091）

3 討 論

動脈粥樣硬化的本質(zhì)是慢性炎癥過程，單核/巨噬細胞是AS斑塊形成中最重要的細胞之一。CD40受體與CD40配體（CD40L）是一對互補跨膜蛋白，分別屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）和TNFR超家族成員，幾乎可在人AS病變中所有的細胞類型（如巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞）中表達[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定心絞痛組外周血可溶性CD40L水平、T細胞與血小板膜表面CD40L明顯高于穩(wěn)定心絞痛組與對照組，血清sCD40L濃度明顯升高者繼發(fā)生心肌梗死、中風或心血管死亡率明顯增高，而對照組沒有心血管疾病發(fā)生[7]。體內(nèi)及體外的研究證實，不論是自身、局部或外源性的CD40L均可刺激粥樣斑塊相關(guān)細胞（淋巴細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞）表達和產(chǎn)生一系列與斑塊發(fā)生、斑塊破裂和血栓形成有關(guān)的活性物質(zhì)，如黏附分子、細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、組織因子等?；|(zhì)金屬蛋白酶是一種依賴Zn2＋和Ca2＋的酶家族，能特異性地與細胞外基質(zhì)各成分相結(jié)合，并降解胞外基質(zhì)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)[4]，不穩(wěn)定斑塊，尤其是易發(fā)生破裂的斑塊“肩部區(qū)域”，MMP－9的蛋白及酶活性明顯增加，較穩(wěn)定斑塊高3倍～5倍，且這種 MMP－9的增加主要來源于斑塊內(nèi)的巨噬細胞。多數(shù)學者認為，MMP－9能促進急性冠脈綜合征的發(fā)生、發(fā)展，在臨床上可以作為斑塊的活動性標志。

大量臨床試驗證明，抗血小板藥物在動脈粥樣硬化相關(guān)疾病中能夠降低血管事件的發(fā)生率和病死率。傳統(tǒng)觀念認為，這主要得益于抗血小板藥物抑制血小板聚集和血栓形成的作用。然而，近年來國內(nèi)外為數(shù)不多的研究顯示，抗血小板藥物除能減少血栓形成外，還具有抑制動脈粥樣硬化斑塊進展的作用[8，9]。替羅非班是抗血小板聚集的藥物，作用于血小板聚集的最后階段，即它阻斷了血小板表面Ⅱb/Ⅲa受體，抑制了纖維蛋白原形成。那么，它除了抑制血小板聚集，是否還通過其他的機制治療靶病變呢？國外已有體外實驗證明，替羅非班能夠降低激活的血小板和內(nèi)皮細胞之間相互作用后產(chǎn)生MMP－2和MMP－9[10]。本研究發(fā)現(xiàn)替非羅班可明顯抑制sCD40L與MMP－9表達，其作用有時間依賴性，這與已有的報道結(jié)果相吻合。與常規(guī)治療組相比，應(yīng)用替羅非班后12 h、24 h、36 h后MMP－9的表達降低50%、73%和82%；sCD40L的表達降低32%、69%和88%，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此可以看出sCD40L與MMP－9表達變化的趨勢一致。因此，對 MMP－9的抑制可能是通過拮抗CD40/CD40L通路來實現(xiàn)的，從而具有抑制炎癥、穩(wěn)定粥樣斑塊作用，但其作用的靶點和具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制尚不明確。趙永平等[11]研究發(fā)現(xiàn)PPARγ有可能通過阻斷CD40/CD40L而對冠脈具有保護作用，是CD40－CD40L信號通路的上游調(diào)節(jié)機制，但尚需進一步研究。

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