UPLC–MS–MS法快速測(cè)定含乳冷凍飲品中氯霉素殘留量

佘曉麒，韓飛，朱虹，黃皓

（廣東省汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東汕頭 515041）

氯霉素（chloramphenicol）對(duì)各類家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜂蜜制品以及各種傳染性疾病的預(yù)防、控制和治療均起重要作用，因而被廣泛使用，甚至被超量濫用，由此導(dǎo)致消費(fèi)終端食品中含有氯霉素藥物殘留[1–2]。國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，食品中殘留過(guò)量的氯霉素對(duì)人體有毒副作用，能抑制造血機(jī)能，容易引起人體血小板減少性紫癲、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血和溶血性貧血等多種危害，特別是對(duì)早產(chǎn)兒和新生兒產(chǎn)生較為嚴(yán)重的毒性。目前許多國(guó)家都禁止在食用性動(dòng)物飼養(yǎng)和治療過(guò)程中使用氯霉素[3]，即食用性動(dòng)物組織和動(dòng)物源食品中氯霉素不得檢出。

目前，對(duì)水產(chǎn)品、蜂產(chǎn)品、動(dòng)物組織等基質(zhì)中氯霉素的檢測(cè)方法較多，主要有微生物法、酶聯(lián)免疫法、放射性免疫法、金標(biāo)試紙條法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法等[1，4–6],但對(duì)含乳冷凍飲品（雪糕、老冰棍等）中氯霉素殘留量的檢測(cè)方法較少。

超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC–MS/MS）具有快速、靈敏度高、專一性好、不受化學(xué)噪聲干擾等特點(diǎn)，尤其是通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）能進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性，大大降低了檢測(cè)限和假陽(yáng)性。筆者采用UPLC–MS分析含乳冷凍飲品中氯霉素殘留量的方法，以UPLC作為分離手段，有效節(jié)省了分析時(shí)間和流動(dòng)相的消耗量，采用MS–MS對(duì)氯霉素進(jìn)行測(cè)定，有效降低了假陽(yáng)性的出現(xiàn)概率，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。該法可為質(zhì)檢技術(shù)機(jī)構(gòu)監(jiān)控含乳冷凍飲品中氯霉素殘留量提供一種快速準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：ACQUITY UPLC–Xevo型，美國(guó) Waters公司；

氮吹儀：HCG–36型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（250 mg）：德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司；

乙酸乙酯、甲醇、乙腈、丙酮、正己烷：色譜純，美國(guó)TEDIA公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY BHE C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A：0.1% 甲酸水；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.45 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30℃；運(yùn)行時(shí)間：6 min；梯度洗脫條件：0～0.5 min，10%B，0.5～1.5 min，10%～40%B，1.5～3.0 min，40%～80%B，3.0～3.5 min，80%～95%B，3.5～4.5 min，95%B，4.5～6.0 min，95%～10%B。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧接口[ESI]：負(fù)離子模式電離；離子監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；離子源溫度：150℃；霧化氣溫度：400℃；霧化氣流量：900 L/min；錐孔氣流速：20 mL/min；其它條件見(jiàn)表1。

表1 氯霉素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

1.4 樣品前處理

將含乳冷凍飲品室溫解凍，混勻后取約30 mL冷凍飲品置于50 mL的離心管中，加入20 mL乙酸乙酯–高氯酸混合液（體積比99∶1），劇烈振搖 10 min后 超 聲 10 min，以 6 000 r/min離 心15 min，準(zhǔn)確移取10 mL上層有機(jī)溶液，用氮吹儀吹干后，用1.0 mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，再加? mL正己烷渦旋1 min，分層后棄去上層正己烷，水層用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，供UPLC–MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

以ACQUITY BHE C18色譜柱作為分析柱，比較了不同流動(dòng)相對(duì)靈敏度、分離度、峰形等的影響。結(jié)果顯示，水的酸堿度對(duì)于氯霉素分離影響不大，對(duì)質(zhì)譜監(jiān)測(cè)也無(wú)顯著影響；有機(jī)相使用乙腈比使用甲醇時(shí)的氯霉素色譜峰形好，而且使用乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相更有利于ESI源中溶劑的去除；同時(shí)以乙腈–水作為流動(dòng)相具有更高的質(zhì)譜響應(yīng)。因此實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸水溶液–乙腈作為流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件

氯霉素分子式為C11H12Cl2N2O5，在電噴霧源(ESI)中易失去一個(gè)氫原子而帶負(fù)電荷，故選擇ESI負(fù)離子模式對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。用流動(dòng)注射進(jìn)樣方式對(duì)氯霉素的母離子進(jìn)行掃描，得到其準(zhǔn)分子離子峰，以適當(dāng)?shù)呐鲎材芰繉?duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行子離子掃描，選擇響應(yīng)值最強(qiáng)的子離子作為定量離子，選擇響應(yīng)值相對(duì)較強(qiáng)的離子作為定性離子。選擇MRM掃描模式對(duì)母離子與子離子進(jìn)行碎裂電壓及碰撞能量的優(yōu)化，優(yōu)化后的參數(shù)見(jiàn)表1。從質(zhì)譜圖中選擇兩個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的子離子m/z152.0和m/z257.0，以m/z257.0作為定性離子（圖1 A），離子峰度最強(qiáng)的m/z152.0為定量離子（圖1 B）。圖1C為氯霉素總離子流圖，氯霉素保留時(shí)間為2.44 min。

圖1 添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)樣的含乳冷凍飲品樣品UPLC–MS/MS譜圖

2.3 樣品前處理方式與優(yōu)化

氯霉素可以用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑提取，其中乙酸乙酯對(duì)氯霉素的提取效率最高；乙酸乙酯–高氯酸混合液（體積比99∶1）與堿性乙酸乙酯溶液分別提取氯霉素時(shí)，乙酸乙酯–高氯酸混合液能更有效地消除含乳冷凍飲品中的基體干擾；1次正己烷脫脂，可有效去除樣品中的脂肪。實(shí)驗(yàn)將乙酸乙酯–高氯酸混合液抽提濃縮干燥后，經(jīng)正己烷脫脂后的樣品，再進(jìn)一步用Oasis HLB柱和C18柱凈化，UPLC–MS/MS結(jié)果顯示，在MRM色譜圖中，過(guò)柱樣品和未過(guò)柱樣品都幾乎沒(méi)有干擾峰，且Oasis HLB柱和C18柱相比，柱凈化結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明其前處理方式效果比較好，也有可能是因?yàn)楹槔鋬鲲嬈分谢w比較簡(jiǎn)單。

2.4 工作曲線方程及檢出限

將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋后，配制質(zhì)量濃度分別為 0.1，0.2，1.0，5.0，10.0，50.0，100.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并進(jìn)行UPLC–MS–MS測(cè)定。以定量離子對(duì)（m/z320.9,152.0）的峰面積A對(duì)氯霉素質(zhì)量濃度c（ng/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=61.6821c+578.297，線性相關(guān)系數(shù)r=0.998 6。對(duì)添加1.0 μg/kg的氯霉素樣品進(jìn)行測(cè)定，定量離子對(duì)的信噪比為32.4，以信噪比（S/N）等于3時(shí)計(jì)算氯霉素的檢出限，得到本方法檢出限為0.1 μg/kg。

2.5 回收率和精密度試驗(yàn)

對(duì)含乳冷凍飲品中的雪糕、三色雪糕、老冰棍樣品進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加量的濃度為 0.5，1.0，2.0 μg/kg，每個(gè)水平進(jìn)行 5次平行測(cè)定，測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。由表2可知3種水平的加標(biāo)回收率為81.5%～103.4%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.72%～3.18%，符合食品檢驗(yàn)分析的要求。

表2 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定含乳冷凍飲品中氯霉素含量，針對(duì)不同的含乳冷凍飲品，前處理方法可稍做調(diào)整，如含有全脂奶粉較多的冷凍飲品，脂肪含量較高，可適當(dāng)增加離心的速率，延長(zhǎng)離心時(shí)間，增加正己烷脫脂程序；對(duì)于成分復(fù)雜的樣品，建議前處理過(guò)程使用Oasis HLB柱和C18柱，可有效保護(hù)色譜柱和質(zhì)譜儀，這些措施都有利于樣品中氯霉素的提取和檢測(cè)。

UPLC–MS/MS法測(cè)定含乳冷凍飲品中的氯霉素，具有方法特異性強(qiáng)、分析周期短、樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。方法的回收率及精密度均滿足殘留分析要求，適合用于含乳冷凍飲品中氯霉素殘留的分析，為質(zhì)檢技術(shù)機(jī)構(gòu)監(jiān)控含乳冷凍飲品中氯霉素殘留量提供了一種快速準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法。

[1] 王自良，趙坤，張改平.氯霉素的毒性及其在動(dòng)物性食品中的殘留與檢測(cè)[J].河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2005(6): 101–105.

[2] Farombi E O，Joseph O N，Sanusi H W，et al. Chloramphenicol and Ampicillin-induced Changes in Rat Hepatic Esterase and Amidase Activities[J]. Bioscience Reports，2000，20(1): 13–19.

[3] GB/T 22338–2008 動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定[S].

[4] Forti A F，Campana G，Simonella A，et al. Determination of Chloramphenicol in Honey by Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry [J]. Analytica Chimica Acta，2005，529(2):257–263.

[5] 魏林陽(yáng)，徐金晶，吳紅軍.水產(chǎn)品中氯霉素殘留的氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2007，24(2): 201–205.

[6] 謝文，丁慧瑛，章曉氡，等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜、蜂王漿中氯霉素殘留[J].分析化學(xué)，2005，33(12): 61–64.