海藻酸鈉的提純及海藻酸鈣多孔支架的制備*

劉楊 任力 季培紅 王迎軍

(華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院∥國家人體組織功能重建工程技術(shù)研究中心∥廣東省生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室，廣東廣州510640)

隨著生物材料和組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展，根據(jù)組織工程學(xué)的要求，最理想的生物醫(yī)用支架材料應(yīng)該是無毒、生物相容性好、可生物降解且降解產(chǎn)物無毒副作用的天然材料［1-3］.海藻酸鹽由于容易凝膠化、生物相容性好等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品，環(huán)保等領(lǐng)域［4-8］.由于離子交聯(lián)的海藻酸鹽水凝膠可以在冰水、熱水以及室溫條件下形成，而且反應(yīng)條件溫和，簡單易行，且可注射、可原位凝膠化，而被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域［9-10］.

在生物醫(yī)學(xué)系統(tǒng)和組織工程應(yīng)用中，過量異體蛋白質(zhì)的引入會引起強烈的宿主免疫反應(yīng)，因此海藻酸鈉(AlgNa)在應(yīng)用于組織工程研究時必須除去其中過量的蛋白質(zhì)雜質(zhì)［11］.文中通過丙酮沉淀法［12-13］對海藻酸鈉進行了提純，得到了較純的組織工程用海藻酸鈉樣品，該方法所得到的產(chǎn)物純度較高，產(chǎn)物性能穩(wěn)定，并且制備過程簡單.

組織工程支架材料的孔隙率以及其中孔洞的尺寸與分布，對細胞在材料中的粘附、增殖和分化來說至關(guān)重要.海藻酸鈉與鈣離子交聯(lián)能夠形成三維的生物相容性多孔支架材料，可以用來作為細胞生長的外環(huán)境［14］，不同工藝條件下制備出的支架材料的內(nèi)部孔洞結(jié)構(gòu)存在很大的區(qū)別.文中通過CaCl2-AlgNa，CaSO4/GDL-AlgNa，Ca-EDTA/GDL-AlgNa 三種交聯(lián)體系制備了多種海藻酸鈣三維多孔支架材料，其中后兩種體系采用鈣離子原位釋放法交聯(lián)制得.

1 實驗方法

1.1 主要實驗原料

海藻酸鈉原料(實驗試劑)、二水硫酸鈣(AR)、乙二胺四乙酸二鈉(AR)和無水硫酸鈉(AR)由天津福晨化學(xué)試劑廠提供，牛血清蛋白(生化試劑)由上海博奧生物科技有限公司提供，丙酮(AR)由廣東光華化學(xué)廠有限公司提供，CoomassieG-250(超級純)由廣州威佳科技有限公司提供，無水氯化鈣(AR)由天津市化學(xué)試劑一廠提供，碳酸鈣由廣州化學(xué)試劑廠提供，GDL(AR)由ALFA AESAR公司提供.

1.2 海藻酸鈉原料的提純

根據(jù)Vidal-Serp等的方法［12-13］，通過高速離心(GL-10MD，湖南湘儀儀器廠生產(chǎn))、G14漏斗抽濾、丙酮溶解、洗滌、真空干燥、冷凍干燥等過程對海藻酸鈉原料進行提純，重復(fù)此操作3次，最后得到純化后的海藻酸鈉樣品.用精密電子天平(BP211D，美國雙杰兄弟公司)稱量出提純后所得的海藻酸鈉質(zhì)量m2，根據(jù)Q=m2/m1×100%，測定樣品提純的產(chǎn)率Q，其中m1為提純前的原料質(zhì)量.

1.3 純化后海藻酸鈉的表征

為表征材料提純前后結(jié)構(gòu)的變化，對提純前后的樣品進行了紅外測試(iS10，美國NICOLET儀器公司生產(chǎn))，掃描范圍為4000～400 cm-1.相對分子質(zhì)量是決定海藻酸鹽水凝膠等彈性體材料力學(xué)性能的關(guān)鍵因素之一［15］，通過調(diào)整海藻酸鈉的相對分子質(zhì)量可以控制離子交聯(lián)的海藻酸鹽支架材料的力學(xué)性能［16］.對海藻酸鈉溶液進行GPC測試(HT-GPC，美國VISCOTEK公司生產(chǎn))，進樣體積為100 μL.精確稱取提純前和提純后的海藻酸鈉樣品各5 mg，分別溶于100 mL水中，根據(jù)文獻［13］中所報道的方法，利用紫外分光光度計(UV-3802，優(yōu)尼特設(shè)備有限公司生產(chǎn))測定了純化前和純化后的樣品中蛋白質(zhì)雜質(zhì)的含量.

1.4 海藻酸鈣多孔支架的制備

配制質(zhì)量分數(shù)分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的AlgNa溶液和0.2mol/L的CaCl2溶液，分別取以上5種濃度的AlgNa溶液各20mL于編號為A1-A5的燒杯中，確定一個固定值 P=［Ca2+］/［COO-］=0.18［13］，加入對應(yīng)量的 CaCl2溶液，攪拌5min.

配制質(zhì)量分數(shù)分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的AlgNa溶液，分別取以上5種濃度的海藻酸鈉溶液各20 mL置于編號為B1-B5的燒杯中，確定P=［Ca2+］/［COO-］=0.18［13］、確定 Q=［GDL］/［Ca2+］=2，加入對應(yīng)量的CaSO4·2H2O和GDL粉末，磁力攪拌5min.

稱取7.45g EDTANa2和2g CaCO3粉末放入100 mL去離子水中充分發(fā)生螯合反應(yīng)，形成0.2 mol/L的Ca-EDTA溶液，并配制質(zhì)量分數(shù)分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的AlgNa溶液.分別取這5種濃度的海藻酸鈉溶液各20 mL置于編號為C1-C5的燒杯中，確定 P=［Ca2+］/［COO-］=0.18［13］、確定 Q=［GDL］/［Ca2+］=2，加入對應(yīng)量的 Ca-EDTA溶液和GDL粉末，磁力攪拌5min.

將以上3種交聯(lián)體系在室溫下靜置60 min，待溶液交聯(lián)形成水凝膠后，將水凝膠放入-20℃冰箱中放置4h，再轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中放置2h，然后將冷凍后的水凝膠冷凍干燥48 h，得到具有三維多孔結(jié)構(gòu)的支架材料.

1.5 海藻酸鈣多孔支架的表征

制備大小為6mm×6mm×5mm的3種體系制得的海藻酸鈣支架樣品，真空下對樣品表層噴金，加速電壓10kV，進行掃描電鏡(JSW-6360LV，日本島津公司生產(chǎn))觀察.將由1%、1.5%、2%、2.5%、3%的海藻酸鈉制備出的海藻酸鈣支架材料制備成大小為1.0cm×1.0cm×1.5cm的柱狀，利用萬能電子拉力試驗機(AG-1型，日本島津公司生產(chǎn))進行載荷測試，加壓速度為2 mm/min.對Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系中由2.5%的海藻酸鈉溶液制備出的海藻酸鈣三維多孔支架進行Micro-CT評價測試(eXplore Locus，通用電氣公司生產(chǎn))，測定支架材料的比表面積、孔徑以及一些其他結(jié)構(gòu)信息.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 海藻酸鈉的提純產(chǎn)率

提純后的海藻酸鈉質(zhì)量m2=1.637g，提純前的原料質(zhì)量m1=3 g，樣品產(chǎn)率Q=54.6%.這表明通過高速離心、G4漏斗抽濾、丙酮沉淀、洗滌、真空干燥、冷凍干燥等過程，去掉了海藻酸鈉原料中的大量雜質(zhì)，得到了較純的海藻酸鈉樣品.

2.2 紅外光譜分析

圖1 海藻酸鈉的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of sodium alginate

圖1是將提純前和提純后的海藻酸鈉樣品在4000～400cm-1區(qū)間內(nèi)進行紅外光譜掃描得到的譜圖.其中顯示了海藻酸鈉的一些特征吸收峰:O—H的吸收峰為3450cm-1，C—H的伸縮振動吸收峰為2930cm-1，1200～1300cm-1的寬強吸收峰是海藻酸鈉中—O—基團的吸收峰，1610 cm-1處是吡喃環(huán)化合物C—O—C的伸縮振動峰，1030 cm-1附近的吸收峰是海藻酸鈉中環(huán)醇結(jié)構(gòu)上的—OH的振動峰.另外，相比提純前的海藻酸鈉，提純后的海藻酸鈉樣品在1420cm-1左右出現(xiàn)的吸收峰明顯減弱，而這正是蛋白質(zhì)氨基酸中羧酸根離子的對稱伸縮振動峰，這表明提純后材料中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量大為減少.

2.3 GPC測定的海藻酸鈉相對分子質(zhì)量

通過調(diào)節(jié)海藻酸鈉的相對分子質(zhì)量可以控制離子交聯(lián)的海藻酸鹽支架材料的力學(xué)性能.凝膠滲透色譜法測定提純后的海藻酸鈉的數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn)為1.48×105，重均相對分子質(zhì)量(Mw)為2.65×105，峰值相對分子質(zhì)量(Mp)為2.24 ×105，Z均相對分子質(zhì)量(Mz)為4.15×105.海藻酸鈉樣品的多分散性系數(shù)(Mw/Mn)為1.79～1.80，屬于一般多分散性樣品.相較于初始原料，提純后樣品的相對分子質(zhì)量有一定的下降，這可能與提純過程中機械應(yīng)力和有機溶劑的作用使聚合物的分子鏈斷裂有關(guān).

2.4 剩余蛋白質(zhì)的含量

圖2是利用紫外分光光度計測定的蛋白質(zhì)溶液在589nm處的吸光度-濃度標準曲線.提純前的海藻酸鈉中蛋白質(zhì)的含量高達(40±5)%.而純化后得到的樣品溶液中蛋白質(zhì)的濃度僅為1.7072mg/L，剩余蛋白質(zhì)雜質(zhì)的質(zhì)量僅占純化后樣品總質(zhì)量的3.4%，低于文獻中所報道的其他方法，如酸沉淀法(約為6.7%)和活性炭法(約為8.5%)結(jié)果［13］.研究表明，純化后，海藻酸鈉原料中超過90%的蛋白質(zhì)雜質(zhì)被除掉，得到了較純的海藻酸鈉樣品.

圖2 蛋白質(zhì)含量的標準曲線Fig.2 Standard curve of protein content

2.5 海藻酸鈣支架的SEM圖像

組織工程支架材料的孔隙率以及其中孔洞的尺寸與分布，對細胞在材料中的粘附、增殖和分化來說至關(guān)重要，不同工藝條件下制備出的海藻酸鈣支架材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在很大的區(qū)別.圖3是未交聯(lián)的海藻酸鈉凍干樣品的SEM照片，未交聯(lián)的海藻酸鈉呈片層狀且結(jié)構(gòu)稀疏而不規(guī)則.

圖3 未交聯(lián)的AlgNa的SEM圖Fig.3 SEM images of sodium alginate(uncrosslinked)

圖4(a)-(e)是由CaCl2-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣三維多孔支架的SEM圖像.通過掃描電鏡對材料中孔徑大小及孔隙分布的觀察發(fā)現(xiàn)，在CaCl2-AlgNa這一交聯(lián)體系中，交聯(lián)明顯但不均勻.這是由于CaCl2溶液在加入到該體系中時，直接以Ca2+溶液的形式參加交聯(lián)反應(yīng)，不存在Ca2+緩慢釋放的過程，Ca2+在加入到海藻酸鈉溶液中時立刻發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，溶液的凝膠化又限制了Ca2+在整個體系的流動，造成了材料局部交聯(lián)明顯但交聯(lián)不夠的現(xiàn)象，過快的凝膠化速率導(dǎo)致了材料內(nèi)部交聯(lián)程度的不同以及材料結(jié)構(gòu)的不均勻等缺陷.

圖4 CaCl2-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣支架SEM圖Fig.4 SEM images of calcium alginate porous scaffolds from(CaCl2-AlgNa)crosslinked system

圖5(a)-(e)是在CaSO4/GDL-AlgNa交聯(lián)體系中通過不同濃度的海藻酸鈉制備的海藻酸鈣三維多孔支架的SEM圖.CaSO4/GDL-AlgNa交聯(lián)體系的交聯(lián)程度較好，在該體系中雖然存在Ca2+緩慢釋放的過程，但由于Ca2+通過CaSO4固體溶解釋放出來的速率以及Ca2+在不同位置的濃度變化難以調(diào)節(jié)，其凝膠動力學(xué)不易控制，同時未反應(yīng)的CaSO4固體也很難從支架材料中脫除，故在所得的支架材料中存在明顯的白色沉淀，這種不均勻的凝膠化導(dǎo)致材料不同部位的成分和結(jié)構(gòu)存在很大的差異，沉淀物的存在降低了材料結(jié)構(gòu)的均一性.

圖5 CaSO4/GDL-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣支架的SEM圖Fig.5 SEM images of porous calcium alginate scaffolds fabricated from CaSO4/GDL-AlgNa crosslinking system

圖6 Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣支架的SEM圖Fig.6 SEM images of porous calcium alginate scaffolds fabricated from Ca-EDTA/GDL-AlgNa crosslinking system

圖6(a)-(e)是由Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系制備的海藻酸鈣三維多孔支架的SEM照片.通過掃描電鏡對材料中孔徑大小及孔隙分布的觀察發(fā)現(xiàn)，在Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系中，海藻酸鈣支架的交聯(lián)程度較好且十分均一，材料中的微孔分布均勻，比表面積較大.這是由于 Ca2+在從 Ca-EDTA這一螯合體系中釋放出來之前已經(jīng)均勻地分布在整個海藻酸鈉溶液當中，隨后其釋放速率和濃度均能夠通過GDL來調(diào)節(jié)，整個交聯(lián)反應(yīng)同時同步在整個體系的所有部位發(fā)生，而且Ca2+在整個Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系的各個部位，從頭到尾都保持著均一的濃度，使得材料整體的交聯(lián)反應(yīng)同時發(fā)生并且均一.其中由質(zhì)量分數(shù)為2.5% ～3.0%的海藻酸鈉所制得的海藻酸鈣三維多孔支架材料中的孔徑分布在50～200μm之間，這種孔徑有利于細胞的生長.

在以上3種交聯(lián)體系中，Ca2+從各體系中釋放的方式以及海藻酸鈉溶液質(zhì)量分數(shù)的不同導(dǎo)致了各種海藻酸鈣支架材料在結(jié)構(gòu)上存在著巨大的差別.隨著海藻酸鈉濃度的增加，前兩個體系制備的材料的結(jié)構(gòu)不均一現(xiàn)象更為明顯，而在第三個體系中所有材料的結(jié)構(gòu)都很均一.這是由于海藻酸鈉溶液發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成海藻酸鈣時，體系各個部位凝膠化的速度與Ca2+和海藻酸鈉的濃度直接相關(guān)，而溶液一旦凝膠化又會對交聯(lián)劑中Ca2+的釋放以及Ca2+在交聯(lián)體系中的移動造成很大影響.

通過研究，我們發(fā)現(xiàn) CaCl2-AlgNa體系和CaSO4/GDL-AlgNa體系相對 Ca-EDTA/GDL-AlgNa交聯(lián)體系而言，最大的局限在于Ca2+的釋放和Ca2+的移動很難做到在體系中均一同步，因此交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的程度和分布也做不到均一，故而很難得到理想的海藻酸鈣支架材料.

2.6 海藻酸鈣支架材料的抗壓強度

由于CaCl2-AlgNa、CaSO4/GDL-AlgNa交聯(lián)體系制備出的海藻酸鈣支架材料在成分和結(jié)構(gòu)上明顯不均一，故只對Ca-EDTA/GDL-AlgNa體系制備出的結(jié)構(gòu)均一的海藻酸鈣多孔支架材料進行力學(xué)性能測試.利用萬能電子拉力試驗機測定 Ca-EDTA/GDL-AlgNa體系制備的海藻酸鈣三維多孔支架材料的抗壓性能.在這一交聯(lián)體系中，由質(zhì)量分數(shù)為2.5%和3.0%的海藻酸鈉所制備出的海藻酸鈣支架材料具有較好的力學(xué)強度，其最大承重可達(75.0±5.0)N(圖7(a))，高于相同體系制備的其他支架材料;濃度為3.0%的海藻酸鈉制備出的三維支架材料的抗壓強度更是高達0.8MPa(圖7(b)).研究結(jié)果表明，在合適的交聯(lián)體系中，由一定質(zhì)量分數(shù)的海藻酸鈉溶液制備出來的海藻酸鈣支架材料具有較好的抗壓能力，該材料能夠通過裁剪得到各種形態(tài)的三維支架.

圖7 Ca-EDTA/GDL-AlgNa體系制備的海藻酸鈣支架的最大承重和抗壓強度Fig.7 Maimum load and compression strength of porous calcium alginate scaffold fabricated from Ca-EDTA/GDL-AlgNa crosslinking system

2.7 海藻酸鈣支架材料的Micro-CT評價

對質(zhì)量分數(shù)為2.5%的海藻酸鈉溶液制備出的海藻酸鈣支架材料進行 Micro-CT評價測試.圖8(a)是對海藻酸鈣支架材料進行Micro-CT評價測試掃描的一個斷面圖，圖8(b)是海藻酸鈣材料表面結(jié)構(gòu)的重建圖.可以看出所得材料的內(nèi)部具有較高的孔隙率，孔隙分布均勻，且孔隙之間相互貫通.此外，通過Micro-CT的測試結(jié)果還可得知該海藻酸鈣多孔支架材料的比表面積為123.27，壁厚為4.08×10-3cm，結(jié)構(gòu)模型指數(shù)為1.99，各向異性程度為3.15，分形維數(shù)為2.41，微孔的體積大約為5.10×10-7cm3，材料的孔徑大致分布在75～85 μm之間.通過Micro-CT掃描可以對材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有一個更加清晰的了解，為后續(xù)的相關(guān)研究提供一定的參考，這種支架材料有可能為細胞的粘附、生長、增殖和分泌細胞外基質(zhì)提供一個合適的三維空間.

圖8 支架斷面圖和表面結(jié)構(gòu)重建圖Fig.8 Cross-section and reconstruction images of scaffold surface

3 結(jié)論

文中采用丙酮沉淀法對海藻酸鈉進行了提純，得到了較純的組織工程用海藻酸鈉樣品.此外，通過 CaCl2-AlgNa，CaSO4/GDL-AlgNa，Ca-EDTA/GDLAlgNa三種交聯(lián)體系制備了多種海藻酸鈣三維多孔支架材料.研究表明:通過Ca-EDTA/GDL-AlgNa這一交聯(lián)體系制備出的支架材料中，由質(zhì)量分數(shù)為2.5%～3.0%的海藻酸鈉所制得的海藻酸鈣三維多孔支架材料的微孔分布均勻，比表面積較大，孔徑在50～200μm之間，且具有較好的機械強度，這樣的支架材料有可能用作組織工程和細胞工程培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基和一些其他用途的醫(yī)用敷料.

［1］Langer R，Vacanti J P.Tissue engineering ［J］.Science，1993，260(5110):920-926.

［2］Bouhadir K H，Lee K Y，Alsberg E，et al.Degradation of partially oxidized alginate and its potential application for tissue engineering ［J］.Biotechnol Prog，2001，17(5):945-950.

［3］Boontheekul T，Kong H J，Mooney D J.Controlling alginate gel degradation utilizing partial oxidation and bimodal molecular weight distribution ［J］.Biomaterials，2005，26(15):2455-65.

［4］詹現(xiàn)璞，吳廣輝.海藻酸鈉的特性及其在食品中的應(yīng)用［J］.食品工程，2011(1):7-10.Zhan Xian-pu，Wu Guang-hui.Characteristics of sodium alginate and its application in food ［J］.Food Engineering，2011(1):7-10.

［5］Zhao L，Weir M D，Xu H H K.An injectable calcium phosphate-alginate hydrogel-umbilical cord mesenchymal stem cell paste for bone tissue engineering ［J］.Biomaterials，2010，31(25):6502-6510.

［6］魏東洋，王飛，劉廣立，等.海藻酸鈉強化超濾含銅廢水［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34(4):77-80.Wei Dong-yang，Wang Fei，Liu Guang-li，et al.Sodium alginate improved ultrafiltration contain copper wastewater［J］.Environmental Science and Technology，2011，34(4):77-80.

［7］王宏麗，張利，左奕，等.海藻酸鈉的疏水必性及其對藥物的緩釋［J］.功能材料，2010，41(9):1568-1571.Wang Hong-li，Zhang Li，Zuo Yi，et al.The hydrophobic modification of sodium alginate and its drug release ［J］.Journal of Functional Materials，2010，41(9):1568-1571.

［8］Bidarra S J，Barrias C C，Barbosa M A，et al.Immobilization of human mesenchymal stem cells within RGD-grafted alginate microspheres and assessment of their angiogenic potential［J］.Biomacromolecules，2010，11(8):1956-1964.

［9］Jiang F X，Yurke B，F(xiàn)irestein B L，et al.Neurite out growth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses［J］.Ann Biomed Eng，2008，36(9):1565-1579.

［10］Wu L B，Jing D Y，Ding J D.A room-temperature injection molding/Particulate Leaching approach for fabrication of biodegradable three-dimensional Porous scaffolds［J］.Biomaterials，2006，27(2):185-191.

［11］Godek M L，Duehsherer M L，MeElwee Q.Morphology and growth of murine cell lines on model biomaterials［J］.Biomed Sci Instrum，2004，40:7-12

［12］Vidal-Serp D S，Wandery C.Purification of natural anionic polymers［J］.Minerva Biotecnologica，2005，17:215-229.

［13］齊欲莎.組織工程用海藻酸鈉及其水凝膠的制備與性能研究［D］.廣州:暨南大學(xué)材料學(xué)院，2008.

［14］Shapiro L.用于細胞培養(yǎng)和移植的新型海藻酸鹽海綿體［J］.國外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程冊，1998，21(2):124-125.Shapiro L.A new type of alginate salt sponge body used for cell culture and transplantation ［J］.Foreign medical biomedical engineering books，1998，21(2):124-125.

［15］Sohneider S，F(xiàn)eilen P J，Kraus O.Biocompatibility of alginates for grafting:Impact of alginate molecular weight［J］.Biotechnol，2002，31:383-394.

［16］King K.Changes in the functional properties and molecular weight of sodium alginate followingy γ irradiation［J］.Food Hydrocolloid，1994，8(2):83-96.