不同研究條件對(duì)BALB/C小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響

喬向陽(yáng)，王曉英，劉宏云

（1.西安市第九醫(yī)院新豐精神病院，陜西 西安 710004；2.西安市東方醫(yī)院精神科，陜西 西安 710043）

抑郁癥動(dòng)物模型有著與人類抑郁癥較高的相似性，被廣泛用于抑郁癥的基礎(chǔ)與臨床研究[1-2]。自從20世紀(jì)70年代Porsolt等設(shè)計(jì)并應(yīng)用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)研究藥物的抗抑郁效應(yīng)以來(lái)，作為一種快速、簡(jiǎn)便，具有較高可信度的動(dòng)物模型，強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥的篩選和評(píng)價(jià)以及抑郁癥機(jī)制的研究中[3-4]。但是，目前實(shí)驗(yàn)方法學(xué)和文獻(xiàn)對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳的實(shí)驗(yàn)條件的研究報(bào)道并不統(tǒng)一。以往的研究表明：眾多因素例如性別、品系和實(shí)驗(yàn)裝置都可能影響小鼠在強(qiáng)迫游泳模型中的表現(xiàn)，這給后續(xù)研究者帶來(lái)很大的不便。為此，本研究通過(guò)選擇近交系(BALB/C)小鼠對(duì)不同性別、晝夜間、不同水溫條件下強(qiáng)迫游泳行為的觀察，深入探討性別、晝夜節(jié)律以及水溫等因素對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下小鼠強(qiáng)迫游泳模型的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/C小鼠共88只，其中雌性32只，雄性56只，每4只小鼠同籠飼養(yǎng)。小鼠隨機(jī)進(jìn)行分組，每8只為一組，各組間的小鼠體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。飼養(yǎng)條件：室溫（22±1）℃；日光燈采光，光暗周期12/12（光照時(shí)間為7：00 a.m.～19：00 p.m.）；動(dòng)物自由獲取食物和水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)前5 d，實(shí)驗(yàn)者每天抓摸小鼠6 min使其適應(yīng)搬弄和觸摸。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)前將小鼠放入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)30 min。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的時(shí)間為：白天8：30～11：30，夜間：20：30 ～23：30。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠放入缸底直徑15.8 cm、高24.5 cm、水深10 cm的透明有機(jī)玻璃缸中，水溫分別取（12±1）℃、（22 ±1）℃、（32±1）℃，每缸1只，缸周圍用不透明鐵框隔離。對(duì)小鼠在缸中游泳情況進(jìn)行攝像，共6 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察并記錄后4 min內(nèi)小鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間是指小鼠在水中停止掙扎呈漂浮狀態(tài)，或者僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部在水面上。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后擦干小鼠并換水。對(duì)不同性別、水溫及晝夜間小鼠的不動(dòng)時(shí)間進(jìn)行比較時(shí)，只保證單一變量，其他非研究因素均相同。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行獨(dú)立樣本均數(shù)間的兩兩比較，采用One-Way ANOVA以及Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)間的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 性別對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 體重相近BALB/C小鼠在保證晝夜節(jié)律、水溫等其他因素相同的情況下，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明雌雄小鼠之間不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 性別對(duì)BALB/C小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響

2.2 晝夜節(jié)律對(duì)BALB/C小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 體重?zé)o差異的BALB/C雄鼠和雌鼠在其他因素相同的情況下，分別在晝夜進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BALB/C雄鼠白天的不動(dòng)時(shí)間明顯長(zhǎng)于夜間（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 晝夜節(jié)律對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響

2.3 水溫對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 保證其他因素相同的情況下，對(duì)于體重相近的BALB/C雄鼠在晚上進(jìn)行的、不同水溫條件下強(qiáng)迫游泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：水溫對(duì)BALB/C雄性小鼠的不動(dòng)時(shí)間有顯著影響（P＜0.05）。BALB/C雄性小鼠在22℃水溫的不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)于其在12℃、32℃水溫的不動(dòng)時(shí)間，見(jiàn)圖3。

圖3 水溫對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響。

3 討 論

小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠被迫在一個(gè)相對(duì)局限的空間內(nèi)游泳，在一定時(shí)間內(nèi)經(jīng)歷不斷泳動(dòng)試圖逃生到漂浮不動(dòng)放棄逃脫（即“行為絕望”）的外顯行為類似于人類抑郁癥的臨床表現(xiàn)[5]。盡管強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于抑郁癥的基礎(chǔ)研究以及抗抑郁效應(yīng)的評(píng)價(jià)，然而到目前為止，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，為了增強(qiáng)抑郁小鼠行為的敏感性、有效性和可靠性，需要考慮的因素很多。本實(shí)驗(yàn)采用的10 cm水深既能夠保證小鼠的后爪能夠剛剛接觸水底又不能使其支撐住身體，這樣的設(shè)計(jì)在保證動(dòng)物身體平衡的條件下避免了溺水現(xiàn)象的出現(xiàn)。如果想深入研究小鼠游泳和爬壁時(shí)間，可以適當(dāng)增加玻璃缸的直徑和水深[6]。另外，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)保證各組間小鼠的年齡無(wú)明顯差異，年齡這一變量可用體重來(lái)間接反映。有研究表明青年小鼠與老年小鼠間的不動(dòng)時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且對(duì)抗抑郁藥的敏感性也有很大不同[6]。保證環(huán)境安靜也是強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)所必需，實(shí)驗(yàn)小鼠之間宜用不透明鐵框相隔，未實(shí)驗(yàn)的小鼠應(yīng)與實(shí)驗(yàn)小鼠隔離，每次實(shí)驗(yàn)完畢均應(yīng)換水并清洗玻璃缸，這些措施可以有效避免環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[7]。除此以外，有研究表明限制動(dòng)物飲食以及飼養(yǎng)方式對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳行為均有一定影響[8]。

本次實(shí)驗(yàn)選擇水溫、晝夜節(jié)律和性別作為主要研究因素，觀察它們對(duì)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)BALB/C小鼠在不同水溫下其不動(dòng)時(shí)間有明顯的差異。12℃水溫下小鼠的抑郁行為出現(xiàn)的最早，這可能是由于低溫會(huì)抑制小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)小鼠為了保持體溫的穩(wěn)定會(huì)盡量減少代謝，反映為在水中較早出現(xiàn)抑郁樣行為[6]。成年小鼠在生理情況下體溫保持37℃～39℃，而環(huán)境溫度改變時(shí)，動(dòng)物體溫也會(huì)相應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。在22℃水溫下，小鼠的不動(dòng)時(shí)間明顯長(zhǎng)于在32℃水溫下的不動(dòng)時(shí)間。這可能是因?yàn)?2℃與小鼠生理體溫相近，對(duì)小鼠的刺激較小，不動(dòng)時(shí)間也相對(duì)較短。

本研究結(jié)果還表明，在沒(méi)有干預(yù)因素的狀態(tài)下，同品系中雄鼠的陽(yáng)性結(jié)果明顯多于雌鼠。以往的研究也發(fā)現(xiàn)使用不同性別的動(dòng)物會(huì)對(duì)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)有一定的影響。丙咪嗪和帕羅西汀對(duì)雄鼠和雌鼠都具有抗抑郁效應(yīng)，不過(guò)所需劑量有差異[9]。FVB雌鼠較雄鼠在同樣條件下漂浮時(shí)間更短[10]。究其原因，可能是由于雌鼠相比雄鼠而言有著更為復(fù)雜的生理周期，且易受該周期的影響。雌鼠的生理周期對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的干擾，使得實(shí)驗(yàn)條件的單一變量對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響增大。本研究提示：要使強(qiáng)迫游泳的結(jié)果更加靈敏、穩(wěn)定可靠，宜選擇雄鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

小鼠屬于嚙齒類夜行性動(dòng)物，神經(jīng)內(nèi)分泌因素導(dǎo)致其在白天的活動(dòng)度明顯少于夜間。然而，以往生物節(jié)律因素對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳行為的影響存在爭(zhēng)議。有研究表明C3H/Hen小鼠在中午的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯比早上和下午長(zhǎng)[11]。而B(niǎo)ALB/C小鼠和C57BL/6J小鼠在中午、初夜和午夜的不動(dòng)時(shí)間無(wú)明顯差異[12]。根據(jù)以往的研究結(jié)果結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)認(rèn)為，晝夜節(jié)律對(duì)小鼠會(huì)產(chǎn)生一定影響，小鼠白天的不動(dòng)時(shí)間明顯長(zhǎng)于夜間的不動(dòng)時(shí)間，在白天小鼠更容易產(chǎn)生抑郁樣行為。晝夜節(jié)律對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響程度因小鼠品系不同而異。要增加小鼠強(qiáng)迫游泳的靈敏性，宜在白天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，盡管強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)有一定的局限性，并受到多種因素的影響，但作為一種簡(jiǎn)單易行的抑郁癥研究和抗抑郁藥篩選的動(dòng)物模型仍具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)影響小鼠強(qiáng)迫游泳行為的晝夜節(jié)律、性別、以及水溫等主要因素進(jìn)行了一些有益的探索，后續(xù)還需研究品系間的差異。

[1]王瑋文,邵 楓,劉 美,等.慢性應(yīng)激損害大鼠信號(hào)逆反學(xué)習(xí)能力：一種新的T型水迷宮檢測(cè)方法[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2009,35(1)：43.

[2]劉永峰,閔 蘇,董 軍,等.無(wú)抽搐電休克治療大鼠抑郁癥與海馬氨基丁酸通路的關(guān)系[J].中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志,2009,35(4)：239-240.

[3]Porsolt RD,Le Pichon M,Jalfre M.Depression：a new animal model sensitive to antidepressant treatments[J].Nature,1977,266：730-732.

[4]楊福中,施慎遜.強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用及進(jìn)展[J].上海精神醫(yī)學(xué),2009,21(3)：188-190.

[5]馬 行,庫(kù)寶善,姚海燕,等.對(duì)抑郁模型小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)方法的探討[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,25(3)：230-233.

[6]Petit-Demouliere B,Chenu F,Bourin M.Forced swimming test in mice：a review of antidepressant activity[J].Psychopharmacology(Berl),2005,177：245-255.

[7]吳俊芳,劉 忞.現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究方法[M].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2006：973-974.

[8]Cryan JF,Valentino RJ,Lucki I.Assessing substrates underlying the behavioral effects of antidepressants using the modified rat forced swimming test[J].Neurosci Biobehav Rev,2005,29：547-569.

[9]Voikar V,Koks S,Vasar E,et al.Strain and gender differences in the behavior of mouse lines commonly used in transgenic studies[J].Physiol Behav,2001,72：271-281.

[10]Alonso SJ,Castellano MA,Afonso D,et al.Sex differences in behavioral despair：relationships between behavioral despair and open field activity[J].Physiol Behav,1991,49：69-72.

[11]Dubocovich ML,Mogilnicka E,Areso PM.Antidepressant-like activity of the melatonin receptor antagonist,luzindole(N-0774),in the mouse behavioral despair test[J].Eur J Pharmacol,1990,182：313-325.

[12]Raghavendra V,Kaur G,Kulkarni SK.Anti-depressant action of melatonin in chronic forced swimming-induced behavioral despair in mice,role of peripheral benzodiazepine receptor modulation[J].Eur Neuropsychopharmacol,2000,10：473-481.