新疆硝爾庫勒鹽湖放線菌分離方法的初步研究

陳正軍 關(guān)統(tǒng)偉 張利莉*

放線菌是一類具有高G+C%含量的革蘭氏陽性細(xì)菌，由于菌落呈放射狀而得名，因其產(chǎn)生許多重要的生物活性物質(zhì)而受到微生物學(xué)家的廣泛關(guān)注［1］。目前在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的抗生素中大約2/3是由放線菌生產(chǎn)的［2］。當(dāng)人們從普通環(huán)境中尋找新型活性物質(zhì)日益困難時(shí)，極端環(huán)境成為人們發(fā)現(xiàn)新放線菌物種及新生物活性物質(zhì)的沃土。目前普遍認(rèn)為，用一般的分離方法從環(huán)境樣品中獲得的微生物純培養(yǎng)物重復(fù)性非常高，也很難再分離到新物種，研究也發(fā)現(xiàn)多數(shù)用于普通環(huán)境放線菌分離的培養(yǎng)基并不適用于高鹽環(huán)境放線菌的分離［3，4］，這無疑限制了極端環(huán)境微生物資源的挖掘。因此，探索有效的微生物分離方法，從不同角度、不同層次建立分離微生物的新方法就成了微生物工作者一項(xiàng)長期的任務(wù)［5］。本研究站在營養(yǎng)生理學(xué)的角度，考慮到鹽湖是一個(gè)高鹽、寡營養(yǎng)的特殊環(huán)境和高鹽環(huán)境放線菌生長緩慢等因素，以微生物對(duì)滲透壓的調(diào)節(jié)機(jī)制為指導(dǎo)，設(shè)計(jì)了以不同碳源和氮源為基礎(chǔ)的多種不同類型的培養(yǎng)基，以期為高鹽環(huán)境放線菌的分離提供有價(jià)值的信息。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

鹽湖沉積物樣品于2009年11月采自位于新疆阿圖什市境內(nèi)的硝爾庫勒湖。該湖呈東北－西南向分布，湖長18～20 km，寬2～4 km，面積 45 km2，海拔為 1 585 m(76°53＇E，40°10＇N)［6］。樣品采集后立即裝入無菌的封口袋并置于車載冰箱。運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后于－20℃保存?zhèn)溆?。稱取適量沉積物置于無菌培養(yǎng)皿中，放于室溫自然風(fēng)干25～30 d。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

PCR儀為德國SensoQuest Labcycler;高速冷凍離心機(jī)為BeckMan公司Allegra 64R Centrifuge;凝膠成像分析系統(tǒng)為Bio－Rad公司Gel Doc 2000;電泳儀為北京六一DYY－6C;用于PCR擴(kuò)增的全套試劑均購自廣州東盛生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶Hae III及連接試劑盒PMD18－T購自TaKaRa公司;其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 分離培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)中使用的分離培養(yǎng)基為海藻糖－脯氨酸培養(yǎng)基(TP)［7］、甘露醇 － 酸水解酪蛋白培養(yǎng)基(GW1)［8］、殼聚糖 － 天冬酰胺培養(yǎng)基(F6)［9］和筆者設(shè)計(jì)的8種培養(yǎng)基。8種培養(yǎng)基使用不同的碳源和氮源(A1:海藻糖5 g、酸水解酪蛋白2 g;A2:棉籽糖4 g、酸水解酪蛋白2 g;A3:木聚糖5 g、酸水解酪蛋白2 g;A4:殼聚糖5 g、酸水解酪蛋白2 g;B1:海藻糖5 g、天冬氨酸1 g;B2:海藻糖5 g、谷氨酸1 g;B3:海藻糖5 g、肌酸 1 g;B4:海藻糖 5 g、谷氨酰胺1 g)同時(shí)添加相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(K2HPO41 g、Mg-SO4·7H2O 1 g、CaCO30.2 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、ddH2O 1 L 、Agar 18 g、pH 7.2－7.4、微量鹽 1 mL(0.001 g/L)、復(fù)合維生素 1 mL(0.5 mg/L))。以上所有培養(yǎng)基均添加1.5%、5%、10%、15%、20%、25%6個(gè)濃度梯度的NaCl，并加入50 mg/L的重鉻酸鉀做為非目的菌抑制劑。

1.4 放線菌菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株基因組DNA的提取采用酶解法小量提取總DNA方法［10］，16S rRNA的PCR擴(kuò)增采用引物PA(5＇－ CAGAGTTTGATCCTGGCT － 3＇)和 PB(5＇－AGGAGGTGATCCAGCCGCA －3＇)［11］。反應(yīng)體系(50 uL)為:Taq酶0.2(5 U);10×buffer 5;dNTPs 1(10 mM);PA:1(10 uM/L);PB:1(10 uM/L);BSA:5(25 mg/mL);ddH2O:35.8;模板1。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min;56℃退火1 min;72℃延伸2 min;35個(gè)循環(huán);72℃總延伸8 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送到上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過Blast程序提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對(duì)搜索，下載相關(guān)屬、種近緣菌株的16S rRNA基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用MEGA4.1軟件中的Clustal程序進(jìn)行多序列比對(duì)，將生成的文件用鄰接法(neighbor－joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用bootstrap法［12］，重復(fù)1 000次取樣，分析進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)放線菌分離的影響

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了以傳統(tǒng)的酸水解酪蛋白為氮源，以海藻糖、棉籽糖、木聚糖、殼聚糖為碳源的不同培養(yǎng)基，以文獻(xiàn)中報(bào)道的分離嗜鹽放線菌效果較好的GW1和F6培養(yǎng)基作為對(duì)照，結(jié)果見表1。

表1 不同碳源對(duì)放線菌分離的影響

從表1可以看出，共獲得4個(gè)屬10個(gè)不同種的放線菌。實(shí)驗(yàn)組4種培養(yǎng)基中A1培養(yǎng)基(海藻糖－酸水解酪蛋白)可以分離到3個(gè)屬3個(gè)不同種的放線菌，分離效果最好。同時(shí)表明本課題組的經(jīng)典培養(yǎng)基GW1、F6培養(yǎng)基用于分離硝爾庫勒湖放線菌也可以獲得較好結(jié)果。因此認(rèn)為海藻糖、甘露醇是分離鹽環(huán)境放線菌的最佳碳源。這可能是因?yàn)楹Ｔ逄呛透事洞级际潜容^重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì);而殼聚糖是一種氨基葡萄糖，棉籽糖是植物界廣泛存在的一種三糖，木聚糖則是植物細(xì)胞壁中主要的半纖維素成分。因此，分離高鹽環(huán)境放線菌時(shí)，以一些可以充當(dāng)滲透調(diào)節(jié)物的二糖作為碳源是比較理想的選擇。

值得注意的是，A4培養(yǎng)基(殼聚糖－酸水解酪蛋白)僅分離到1個(gè)屬1個(gè)種的放線菌，F(xiàn)6培養(yǎng)基(殼聚糖－天冬酰胺)卻能分離到3個(gè)屬5個(gè)不同種的放線菌。盡管A4培養(yǎng)基和F6培養(yǎng)基使用的碳源相同，但是當(dāng)培養(yǎng)基中的氮源不同時(shí)分離結(jié)果卻截然不同，這啟發(fā)我們氮源在分離鹽環(huán)境放線菌中具有重要的作用，同時(shí)具有滲調(diào)作用的氮源可能在分離鹽環(huán)境放線菌中顯得更為重要。

2.2 不同氮源對(duì)放線菌分離的影響

以分離效果最好的海藻糖作為碳源，分別以天冬氨酸、谷氨酸、肌酸和谷氨酰胺做為氮源設(shè)計(jì)了4種不同的分離培養(yǎng)基，并且以文獻(xiàn)中報(bào)道的TP培養(yǎng)基作為對(duì)照，結(jié)果見表2。

表2 不同氮源對(duì)放線菌分離的影響

從表2可以看出，共分離到11個(gè)屬22個(gè)不同種的放線菌。以肌酸作為氮源的培養(yǎng)基(B3)分離效果最好，能分離到10個(gè)屬16個(gè)不同種的放線菌。從分離放線菌種屬的數(shù)量來看，以天冬氨酸和谷氨酸作為氮源的培養(yǎng)基(B1、B2)比以谷氨酰胺和脯氨酸作為氮源的培養(yǎng)基(B4、TP)分離效果好，均能分離到5個(gè)屬7個(gè)不同種的放線菌。比較表1和表2的分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B3(海藻糖－肌酸)培養(yǎng)基分離到放線菌種屬的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它所有的培養(yǎng)基。因此，B3培養(yǎng)基可以作為分離鹽湖放線菌的最佳培養(yǎng)基。

2.3 放線菌菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

以16SrRNA相似性小于97%來做為新種和已知種的界限［13］，培養(yǎng)基B1(海藻糖－天冬氨酸)和B2(海藻糖－谷氨酸)各分離到一個(gè)潛在的新種(菌株編號(hào)分別為41376、41293)，將這兩株菌的16S rRNA序列同 GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果同最近種的相似性分別為93%和96%，以鄰接法對(duì)這兩株菌分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖1、圖2)，結(jié)果表明菌株41376和41293分別以極高的自展值在各自的屬內(nèi)形成獨(dú)立的分枝，這兩株菌可能分別是鹽放線孢菌屬和鏈霉菌屬的潛在新種，其確切的分類地位還要通過多相分類手段進(jìn)一步鑒定。從發(fā)現(xiàn)新種的角度來看，具有滲調(diào)作用的不同碳源、氮源組合的培養(yǎng)基，可能在分離鹽環(huán)境放線菌中具有更大的潛力。

圖1 基于16SrRNA序列的菌株41376的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖2 基于16SrRNA序列的菌株41293的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

由于放線菌是一類具有巨大應(yīng)用價(jià)值的微生物，所以開發(fā)放線菌資源就顯得尤為重要。一直以來，分離方法一直是限制人們開發(fā)利用這類微生物資源的“瓶頸”，尤其是高鹽環(huán)境下放線菌的純培養(yǎng)技術(shù)一直沒有突破。所以尋找新的思路、探索新的分離方法就成了放線菌資源研究的主要內(nèi)容之一。分析以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中使用的11種培養(yǎng)基中B3培養(yǎng)基的分離效果最好，分離到放線菌屬和種的數(shù)量最多。分析其培養(yǎng)基組成發(fā)現(xiàn):B3培養(yǎng)基使用的碳源是海藻糖，氮源是肌酸。海藻糖是一種重要的抗逆物質(zhì)，自身性質(zhì)非常穩(wěn)定，能在細(xì)胞表面形成特殊的保護(hù)膜，因此能有效的保護(hù)生物活性物質(zhì)不變性失活，被認(rèn)為是生物抵御環(huán)境脅迫的應(yīng)激代謝物［14］，微生物在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下都能合成海藻糖。肌酸由精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸合成，因此在培養(yǎng)基中它是很好的氮的供體。B1和B2培養(yǎng)基分離效果雖然次于B3培養(yǎng)基，但是同其它8種培養(yǎng)基相比分離效果還是比較好，均能分離到5個(gè)屬7個(gè)不同種的放線菌，甚至能分離到一些新的物種。這兩種培養(yǎng)基所使用的氮源分別是天冬氨酸和谷氨酸，有報(bào)道認(rèn)為［15，16］微生物為了緩解高滲透壓，則通過有機(jī)小分子酸性氨基酸以及通過天門冬氨酸和谷氨酸途徑合成甜菜堿、四氫嘧啶等衍生物，這些滲透物質(zhì)可以迅速地從培養(yǎng)基和環(huán)境中被吸收和積累，從而使微生物細(xì)胞保持穩(wěn)定的滲透壓。本研究也發(fā)現(xiàn)，由于樣品來源不同，相同培養(yǎng)基的分離效果也有較大差異。也有研究［17］發(fā)現(xiàn)十分之一的Gibbson培養(yǎng)基分離嗜鹽菌的效果要明顯優(yōu)于Gibbson培養(yǎng)基。因此，分離高鹽環(huán)境的微生物可以考慮用不同的滲透調(diào)節(jié)物做為碳源和氮源，同時(shí)利用高鹽環(huán)境微生物寡營養(yǎng)的特點(diǎn)改造或設(shè)計(jì)培養(yǎng)基。

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