新疆南疆地區(qū)奶牛乳房鏈球菌gapC基因原核表達載體的構建

張 輝 焦海宏 陳 偉，*

乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)作為引起奶牛乳房炎(mastitis)的主要致病菌之一，致病性與多種毒力因子相關。其中乳房鏈球菌gapC基因編碼的具有3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)活性的一種表位蛋白，即GapC蛋白，是近年來研究較多的一種毒力蛋白，也被認為是一種與毒力相關的免疫調(diào)節(jié)蛋白［1］。GapC蛋白能與血纖維蛋白溶酶結合，在疾病發(fā)展過程和信號轉導過程中起著重要作用，可作為疫苗發(fā)展的良好靶位點［2，3］。因此，研究GapC蛋白的功能可為乳房鏈球菌抗原的篩選、疫苗的研制和奶牛乳房炎的防治提供一定的理論指導。

本研究通過PCR方法擴增乳房鏈球菌臨床分離株的gapC基因，應用基因重組技術，構建乳房鏈球菌gapC基因原核表達載體 pET－32a(+)－gapC，并進行GapC蛋白的誘導表達，獲得GapC蛋白最佳誘導表達條件，為后續(xù)應用該蛋白進行免疫學研究，確定其免疫原性及免疫保護作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器

PCR儀(Bio－Rad)，恒溫培養(yǎng)箱(Boxun，上海)，移液器(Eppendorf)等。恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療器械廠)，金屬浴(金銀杏生物科技，北京)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio－Rad)，蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)，高速臺式離心機(Eppendorf)。

1.2 實驗藥品與試劑

限制性內(nèi)切酶E coRⅠ、X hoⅠ、T4 DNA連接酶、IPTG、氨芐青霉素(AMP)、DNA分子量標準(DL2 000，DL10 000)與表達載體pET－32a(+)均購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR試劑購自東盛生物有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自北京天根生物有限公司;蛋白質(zhì)分子量標準、TEMED、考馬斯亮藍、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、DTT均購自Ameresco公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純或試劑純;BHI培養(yǎng)基(Becton Dickinson)。

1.3 實驗菌株

乳房鏈球菌菌株分離自新疆南疆地區(qū)某奶牛場患乳房炎病牛的乳樣，E.coli DH5a、BL21(DE3)為本實驗室保存。

1.4 目的基因gapC的PCR擴增

1.4.1 引物的設計與合成

根據(jù)Genbank公布的基因序列，查找乳房炎性鏈球菌的gapC基因，設計引物。上游引物為Pet32a－F:5’－ GAGGAATTCATG GTA GTT AAA GTT GGT ATT AAC G －3’，下游引物為Pet32a－R:5’－GGACTCGAGTTA TTT AGC GAT TTT TGC AAA GTA C－3’，預期片段約為1011 bp。上游引物中引入E coR I酶切位點，下游引物中引入X ho I酶切位點(見下劃線部分)，由上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成。

1.4.2 乳房鏈球菌基因組DNA的提取

挑取活化好的乳房鏈球菌單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h左右，12 000 rpm離心5 min收集菌體，按文獻［4］操作步驟稍作改動，提取乳房鏈球菌基因組DNA，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 gapC 基因的 PCR 擴增

以乳房鏈球菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系如表1所示。反應條件:95℃變性5 min;94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30 個循環(huán);72℃延伸10 min。取適量PCR產(chǎn)物電泳檢測(1%瓊脂糖凝膠、120 v、30 min)，EB 染色10 min，凝膠成像系統(tǒng)成像。將所有PCR產(chǎn)物合并后用DNA產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN BIOTECH)純化回收，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 目的基因gapC擴增體系

1.5 重組表達質(zhì)粒的構建

1.5.1 質(zhì)粒載體的純化

將含有質(zhì)粒載體pET－32a(+)的大腸桿菌DH5a活化、搖菌后，用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN BIOTECH)進行質(zhì)粒載體的抽提(方法與步驟見質(zhì)粒小提試劑盒說明書)。電泳檢測抽提效果后，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 載體及目的基因雙酶切

將載體pET－32a(+)用限制性內(nèi)切酶(E coR I、X ho I)進行雙酶切，電泳檢測后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN BIOTECH)回收載體大片段。同時用與酶切載體相同的內(nèi)切酶進行目的基因gapC的雙酶切與純化。

1.5.3 表達載體的構建

取約20 ng(1μL)酶切回收后的載體pET－32a(+)DNA片段，加適量目的基因gapC片段、1μL10×T4 DNA連接緩沖液、1μL T4 DNA連接酶，加ddH2O至10μL，混勻后置于16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉化至E.coli DH5a感受態(tài)細胞中，經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶篩選鑒定，送陽性克隆進行測序。測序正確的陽性克隆進行重組質(zhì)粒的抽提(方法同前)，轉化E.coli BL21(DE3)。將鑒定正確的陽性質(zhì)粒命名為pET－32a(+)－gapC。

1.6 重組蛋白的誘導表達

1.6.1 樣品的制備

取測序正確的菌株(編號B－21)，同時以含質(zhì)粒pET－32a(+)的菌體為對照，接種于含 Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。取此培養(yǎng)物按1%(v/v)的量接種于準備好的含Amp的液體LB培養(yǎng)基中(100 mL)，37℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600值0.4～0.6(約2～3 h)，加 IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的不同時刻(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 h)各取 1 mL 菌液轉移至離心管，10 000 r/min離心5 min，收集菌體沉淀，加入90μL 1×上樣緩沖液和10μL 1 mol/L DTT懸浮混勻，沸水浴5 min，10 000 r/min離心5 min。同時將蛋白質(zhì)分子量標準在沸水中處理5 min。1.6.2 重組蛋白的 SDS－PAGE檢測

制備合適濃度的聚丙烯酰胺凝膠(12%分離膠，5%濃縮膠)，每孔加入20μL樣品，在濃縮膠中采用8 V/cm的電壓進行電泳，在分離膠中采用15 V/cm的電壓進行電泳。電泳結束后取出凝膠用考馬斯亮藍R－250染色液染色30 min左右，然后脫色至背景清晰，用清水沖洗、掃描照相。

1.7 重組蛋白最佳誘導條件的確定

1.7.1 最佳誘導時間的確定

樣品處理方法同前，選擇在培養(yǎng)液中加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L和1 mmol/L，并分別在誘導的不同時間點(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 h)各取 1 mL菌液轉移至離心管，進行SDS－PAGE檢測。

1.7.2 最佳IPTG誘導濃度的確定

確定最佳誘導時間后，進行IPTG最佳誘導濃度的確定。在培養(yǎng)液中加入終濃度依次為 0.0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L、1.25 mmol/L 的IPTG，同時設立空質(zhì)粒對照，培養(yǎng)至最佳誘導時間時取樣，方法同前，進行SDS－PAGE檢測。

2 結果和分析

2.1 目的基因gapC的擴增與序列分析

以乳房鏈球菌基因組DNA為模板，PCR擴增特異性片段并回收，PCR產(chǎn)物及回收產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示，PCR擴增產(chǎn)物在略大于1 000 bp處有一條清晰明亮的DNA條帶(圖1)，與預期片段大小相符?？寺y序后表明為乳房鏈球菌的gapC基因。

圖1 gapC基因的PCR擴增(M為DNA Marker DL2000，1為gapC基因)

2.2 重組表達質(zhì)粒的構建與鑒定

2.2.1 重組表達質(zhì)粒的PCR鑒定

將所構建的原核表達質(zhì)粒 pET－32a(+)－gapC，轉化 E.coli BL21(DE3)，氨芐抗性篩選，對抗性平板上長出的克隆用基于載體設計的通用引物(T7，S－Tag)進行PCR鑒定，疑似陽性克隆12個。部分重組子PCR鑒定結果如圖2所示。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定(+:以質(zhì)粒pET－32a(+)－gapC為模板作陽性對照，－:以質(zhì)粒pET－32a(+)為模板作陰性對照，空:以ddH2 O為模板作空白對照;1、2為待檢重組子;M為DNA Marker DL2000)

2.2.2 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定

對PCR鑒定后陽性重組子抽提質(zhì)粒后電泳檢測。結果顯示，重組質(zhì)粒pET－32a(+)－gapC比質(zhì)粒pET－32a(+)略大(見圖3)。酶切結果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)E coR I單酶切后產(chǎn)生一條約7 kb的DNA條帶，與預期大小6 883 bp相符。經(jīng)E coR I、X ho I雙酶切后出現(xiàn)的兩條 DNA條帶與實際大小(約5.9 kb和1 kb)相符，說明重組質(zhì)粒構建正確。

圖3 重組質(zhì)粒酶切鑒定(1為空質(zhì)粒pET－32a(+)，2為pET－32a(+)雙酶切;3、6為重組質(zhì)粒pET－32a(+)－gapC;4、5為pET－32a(+)－gapC雙酶切;7為pET－32a(+)－gapC單酶切;M為DNA分子量標準)

2.3 重組GapC蛋白最佳誘導條件的確定

2.3.1 重組蛋白最佳誘導時間

IPTG在不同誘導時間對重組質(zhì)粒pET－32a(+)－gapC表達量有明顯影響。未加入IPTG時，重組蛋白產(chǎn)生量極少。當誘導1 h時，表達量開始上升，一直持續(xù)到5 h。6 h時表達量達到最高，隨后表達量略有下降。誘導9 h時，仍有足量的重組蛋白表達(圖4)。因此，確定最佳誘導時間為6 h。

圖4 不同誘導時間重組蛋白的檢測(A:0.5 mmol/L IPTG誘導，B:1.0 mmol/L IPTG誘導)(1、9、13為質(zhì)粒pET32a(+)分別誘導0 h、6 h和9 h;2～8、10～12為重組質(zhì)粒pET－32a(+)－gapC分別誘導0～9 h;M為蛋白分子量標準)

2.3.2 重組蛋白IPTG最佳誘導濃度

在確定最佳誘導時間的基礎上，進一步確定IPTG最佳誘導濃度。結果表明，IPTG在0～1.25 mmol/L濃度范圍內(nèi)，在最佳誘導時間即誘導6 h時，GapC蛋白的表達量隨著IPTG濃度的增大而逐漸增加(如圖5所示)，當IPTG濃度為0.5 mmol/L時，表達量已達到最高。IPTG濃度為0.75 mmol/L和1.0 mmol/L時，GapC蛋白的表達量較 0.5 mmol/L時無明顯變化，而當IPTG濃度提高到1.25 mmol/L時表達量有所降低，說明高濃度的IPTG會抑制重組蛋白的表達。因此，確定最佳誘導濃度為0.5 mmol/L。

圖5 不同濃度IPTG誘導6 h重組蛋白的檢測(1、8為質(zhì)粒pET32a(+)分別誘導0 h和6 h;2～7為重組質(zhì)粒pET－32a(+)－gapC分別在0～1.25 mmol/L 6種不同濃度IPTG誘導下的表達情況，M為蛋白分子量標準)

3 討論

奶牛乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，給奶業(yè)發(fā)展造成了嚴重的經(jīng)濟損失。治療該病目前主要以抗生素為主。但由于抗生素的殘留和耐藥菌的出現(xiàn)，使得治療難度增加，而利用疫苗來控制該病已成為一種趨勢。病原微生物的某些生理代謝酶，是一些功能蛋白作用的良好受體，可作為疫苗的重要靶分子。研究表明具有3－磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)活性的蛋白是細菌、真菌和寄生蟲感染的最佳疫苗靶向［5－7］。而鏈球菌 gapC基因編碼的具有GAPDH活性的表面保守性蛋白，即GapC蛋白，是近年來最受關注的一種毒力蛋白。

不同種類細菌其gapC基因同源性存在很大差異，已經(jīng)有研究報道引起奶牛乳房炎的三種鏈球菌(無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌)之間gapC基因同源性高達88%［8］。這種基因高同源性的存在為利用該基因表達產(chǎn)物獲得免疫保護提供了理論基礎。

有研究表明gapC基因編碼產(chǎn)物3－磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)可與纖維蛋白溶酶結合，以助于病原菌在宿主體內(nèi)定殖［9，10］。因此，從削弱鏈球菌定殖機體能力的角度出發(fā)，針對GADPH蛋白研制鏈球菌性奶牛乳房炎疫苗具有潛在的應用前景。

gapC基因ORF全長1 011 bp，編碼一條336個氨基酸的功能多肽。當gapC與表達載體pET32a(+)連接，構建原核表達系統(tǒng)時，目的蛋白以融合蛋白的形式表達。融合蛋白包括Trx－Tag(分子量約11.7kD)、His－Tag(分子量約0.8 kD)、S－Tag(分子量約1.7 kD)、與目的蛋白相連接的部分氨基酸(分子量約3.8 kD)和目的蛋白GapC(分子量約36.0 kD)。所產(chǎn)生的融合蛋白分子量約54.0 kD(介于43 kD～66.2 kD之間)。同時應用生物學軟件DNAStar對推導的融合蛋白氨基酸序列進行分析，推測其分子量約為53.8 kD，二者結果一致。本研究中SDS－PAGE檢測結果表明，重組蛋白分子量介于43 kD～66.2 kD之間，與預期大小相符，表明重組蛋白成功獲得表達。

本研究成功構建了乳房鏈球菌gapC基因原核表達載體并獲得最佳誘導條件。誘導實驗表明，當IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導時間為6 h時，重組蛋白的表達量達到最高。持續(xù)誘導至9 h時，仍可獲得大量重組蛋白。但隨著誘導時間的增加，表達量不再升高，卻有逐漸下降的趨勢，很可能是重組蛋白合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊而形成了包涵體。本實驗確定的GapC蛋白最佳表達條件與褚明亮等［11］的結果有所不同，可能是在實驗設計及方法選擇上有所不同。在本實驗中，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L的IPTG對目的蛋白表達量的影響并無明顯區(qū)別?？紤]到過高濃度的IPTG可能會使目的蛋白更容易產(chǎn)生包涵體，對后續(xù)目的蛋白的純化實驗造成不良影響，因此，在既滿足實驗要求，又不浪費實驗藥品的前提下，我們選擇IPTG濃度為0.5 mmol/L作為目的蛋白的最佳誘導濃度。GapC蛋白的成功表達和最佳表達條件的建立，為下一步制備重組蛋白抗體、確定抗體免疫原性及免疫保護作用奠定了基礎。

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