實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)非霍奇金淋巴瘤患者B淋巴細(xì)胞刺激因子表達(dá)水平①

王金湖 王 梅 楊劍虹 王旭東 申嫻娟 浦 江 鞠少卿

(江蘇省太倉(cāng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，太倉(cāng) 215400)

B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)是1999年發(fā)現(xiàn)的TNF超家族的成員之一［1］，BAFF具有特異性激活B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞增殖等功能。但新近研究發(fā)現(xiàn)BAFF過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致一些惡性腫瘤的發(fā)生，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)。因此我們利用LightCycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀建立定量檢測(cè)BAFFmRNA的方法，測(cè)定人NHL外周血中BAFF mRNA含量，探討B(tài)AFF基因表達(dá)水平與NHL的相關(guān)性。

1 材料與方法

1．1 試劑與耗材

1．1．1 標(biāo)本來(lái)源 20名健康獻(xiàn)血者，來(lái)自本院體檢中心體檢健康者，其中女性13例，男性7例，年齡18～42歲，平均(25±7)歲。47例NHL患者，2007年8月～2008年8月來(lái)本院和南通大學(xué)附屬醫(yī)院的住院患者，其中男性27例，女性20例，年齡32～83歲，平均年齡(60±7)歲。

1．1．2 主要試劑與儀器 SuperScriptTMⅢ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司);pGEM－T easy載體、質(zhì)粒提取試劑盒、IPTG、dNTPS等(美國(guó) Promega公司);膠回收試劑盒(上海華舜生物工程公司)。PTC－200 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ公司);LightCycler定量PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Roche公司);U－0080D核酸紫外檢測(cè)日本Hitachi公司);Dolphin－Doc凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)WEALTEC公司)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 外周血中單個(gè)核細(xì)胞的分離 無(wú)菌采取新鮮血液3 ml，用EDTA抗凝。取淋巴細(xì)胞分離液(按與血液1∶2的比例)，加入到15 ml錐形離心管中，再將血液沿管壁輕輕鋪到分離液上面，2 000 r/min離心20分鐘，取血漿層與分層液交界處渾濁的灰白層(富含單個(gè)核細(xì)胞)，用生理鹽水洗滌2次，1 500 r/min離心10分鐘，最后棄去上清，－80℃冰箱保存。

1．2．2 引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)根據(jù)BAFF(注冊(cè)號(hào)為AY129225)和內(nèi)參GAPDH(注冊(cè)號(hào)為NC_000012．10)全序列，應(yīng)用 Beacon Designer 2．1軟件，設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程公司合成。BAFF－s 5'－CACGCCTTACTTCTTGCC－3'，BAFF－as 5'－CTTGGAGGATCGGACAG－3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 102 bp;GAPDH－s 5'－CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT－3'，GAPDH－as 5'－AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC－3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度193 bp。

1．2．3 RNA的抽提與逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(RTPCR)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，核酸蛋白紫外分析儀檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。取總RNA 3μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系含 5×RT Buffer，dNTPs，Oligo(dT)18，RNase抑制劑 20 U，RT 酶 4 U，37℃ 1小時(shí)。cDNA置－20℃保存。

1．2．4 目的片段的擴(kuò)增 取 cDNA 3μl，用引物BAFF－S 和 BAFF－AS 于 PTC－200 PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，條件如下:94℃預(yù)變性3分鐘，然后94℃ 30秒，55℃ 40秒，72℃ 30秒共33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。

1．2．5 BAFF定量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 將電泳和膠回收的PCR產(chǎn)物與pGEM－T easy載體4℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α涂布于含X－gal和IPTG并具Amp抗性的1．5%瓊脂平皿上，37℃倒置培養(yǎng)14～16小時(shí)。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，EcoRⅠ酶切初步鑒定，陽(yáng)性克隆行測(cè)序分析(由上海博亞公司完成)。將篩選出的陽(yáng)性菌株擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，準(zhǔn)確定量10倍系列稀釋?zhuān)鳛闃?biāo)準(zhǔn)品－20℃保存。

1．2．6 熒光定量PCR檢測(cè) 反應(yīng)條件93℃預(yù)變性2分鐘，然后93℃ 5秒，60℃ 35秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用計(jì)算機(jī)自動(dòng)根據(jù)循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)與其對(duì)應(yīng)的不同定量模板拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值擬合作圖，繪制出BAFF和GADPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1．2．7 BAFF mRNA的表達(dá)水平檢測(cè) 將標(biāo)本的cDNA模板與不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入18μl PCR反應(yīng)液中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到BAFF和GADPH拷貝數(shù)及相應(yīng)的Ct值。為了消除樣本、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的差異，以BAFFmRNA和GADPH mRNA表達(dá)水平拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值比值作為評(píng)價(jià)BAFF表達(dá)水平的指標(biāo)。

1．3 重復(fù)性試驗(yàn) 選擇高、低兩種濃度的標(biāo)本，批內(nèi)連續(xù)測(cè)定10次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù);同樣將此兩份標(biāo)本連續(xù)測(cè)定5天，每天測(cè)定2次，計(jì)算批間變異系數(shù)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差(S)和變異系數(shù)(CV)。

2 結(jié)果

2．1 RNA的純度與濃度 Trizol法提取NHL患者PBMCs總RNA，經(jīng)1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，顯示清晰的 28S、18S 條帶，28S/18S≥1．5，提示總RNA完整性良好(見(jiàn)圖1)。用核酸蛋白紫外分析儀檢測(cè)A260/A280的比值以鑒定RNA抽提質(zhì)量，1．8≤A260/A280≤2．0，提示總 RNA 質(zhì)量較好，同時(shí)測(cè)其標(biāo)本總RNA濃度為100～860 μg/m l。

2．2 RT－PCR擴(kuò)增目的片段 以cDNA為模板，用BAFF的引物，經(jīng)LightCycler擴(kuò)增應(yīng)得102 bp的目的片段，經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的目的片段大小與預(yù)期值相符合(圖2)?；厥漳康臈l帶用于PCR產(chǎn)物的克隆。

2．3 pGEM－T easy－BAFF質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 經(jīng)膠回收的PCR電泳產(chǎn)物與T載體連接后，轉(zhuǎn)化E．Coli，DH5α，獲得重組質(zhì)粒，挑一個(gè)白色單菌落接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基37℃孵箱培養(yǎng)過(guò)夜，取1 ml放入EP管內(nèi)送去測(cè)序，結(jié)果證實(shí)序列與NCBI基因庫(kù)BAFF序列同源性為100%(圖3)。

圖1 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量Fig．1 1%formaldehyde denaturing agarose gel electrophoresis to detect the quality of total RNA

2．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和方法的特異性 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)瑫r(shí)用建立的熒光定量PCR測(cè)定，顯示靈敏度為10 pg/ml。將檢測(cè)的臨界點(diǎn)定在PCR產(chǎn)物進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的起始點(diǎn)即循環(huán)閾值(threshold cycle，Ct)處。將Ct值與其對(duì)應(yīng)的不同定量模板數(shù)的對(duì)數(shù)值擬合作圖，其中橫坐標(biāo)代表不同定量模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)(log10)，縱坐標(biāo)代表Ct值，得出定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖4A)。顯示Ct值和模板起始濃度的log值之間具有較好的線(xiàn)性關(guān)系r=0．99。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出該樣品的起始模板拷貝數(shù)。為了驗(yàn)證SYBR GreenⅠ染料方法的特異性，測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)(圖4B)，可見(jiàn)熔解曲線(xiàn)峰值單一，表明PCR反應(yīng)條件選擇適當(dāng)，產(chǎn)物特異性強(qiáng)，無(wú)非特異性產(chǎn)物。

2．5 重復(fù)性檢測(cè) 選擇高、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)測(cè)定五天，每天測(cè)定5次，計(jì)算批間變異系數(shù)，得其批間CV;將上述高、低標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測(cè)定10次，得其批內(nèi)CV(見(jiàn)表1)。

2．6 BAFFmRNA在NHL患者外周血中的表達(dá)對(duì)47例NHL患者外周血及健康對(duì)照者PBMCs進(jìn)行定量檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果顯示NHL患者和健康對(duì)照者PBMCs BAFF mRNA表達(dá)量分別為(0．48±0．023，0．25 ± 0．023)，兩組結(jié)果具有顯著性差異(P=0．0001，見(jiàn)圖5)。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig．2 The PCR p roduct in gel electrophoresis

圖3 pGEM-T easy-BAFF克隆測(cè)序結(jié)果Fig．3 The results of cloning and sequencing of pGEM-T easy-BAFF

圖4 BAFF標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(A，R=0．99)和熔解曲線(xiàn)(B)Fig．4 The standard curve(A，R=0.99)and real-time PCR melt curve(B)of BAFF standard sample

表1 BAFF基因熒光定量測(cè)定的批內(nèi)和批間CV值Tab．1 The vatiation coefficients of intra-assay and interassay of BAFF detected by RFQ-PCR

圖5 BAFF在NHL組和正常對(duì)照組PBMCs中的表達(dá)Fig．5 The expression of BAFF in NHL and normal control

3 討論

BAFF通過(guò)與其細(xì)胞表面的3個(gè)受體(TACI、BCMA、BAFF－R)結(jié)合而主要調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活化存活、增生和分泌，還能促進(jìn)免疫球蛋白產(chǎn)生、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［2－4］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究顯示，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征(Sj?gren syndrome，SS)、多發(fā)性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏病(SLE)等疾病患者BAFF及其受體蛋白和(或)mRNA表達(dá)水平有異常改變［5－8］，因此對(duì) BAFF表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量具有重要臨床意義。

為測(cè)定人NHL外周血中BAFFmRNA含量，探討B(tài)AFF基因表達(dá)水平與NHL的相關(guān)性，我們利用LightCycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀建立定量檢測(cè)BAFFmRNA的方法并進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。DNA結(jié)合熒光染料SYBR GreenⅠ是RTFQ－PCR常用的熒光檢測(cè)模式之一，與雜交探針相比，其特異性相對(duì)較低，但操作簡(jiǎn)便、價(jià)格較低，所以應(yīng)用較廣。由于熒光染料可以和所有的DNA結(jié)合，為了避免基因組DNA污染，可采用跨越內(nèi)含子的方法，在BAFF基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，并通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系，設(shè)計(jì)出了熒光染料法檢測(cè)BAFFmRNA定量方法。本課題設(shè)計(jì)的染料法檢測(cè)BAFF的熒光定量PCR方法，在進(jìn)行瓊脂糖電泳時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯的非特異性條帶，并運(yùn)用熔解曲線(xiàn)分析確定熒光捕獲點(diǎn)，以進(jìn)一步確定檢測(cè)的特異性。同時(shí)為了消除樣本、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)的差異，以BAFFmRNA和GADPH mRNA表達(dá)水平拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值比值作為評(píng)價(jià)BAFF表達(dá)水平的指標(biāo)，結(jié)果更為客觀可靠。

我國(guó)淋巴瘤的死亡率為1．5/10萬(wàn)，排在惡性腫瘤死亡的第11～13位。而非霍奇金淋巴瘤占淋巴瘤的90%以上，由于其原發(fā)性結(jié)外組織多見(jiàn)，跳躍性轉(zhuǎn)移的方式，且易發(fā)生早期遠(yuǎn)處擴(kuò)散，有的病例在臨床確診時(shí)已播散全身。因此，我們選擇BAFF在NHL中的作用進(jìn)行研究。國(guó)外已有研究顯示BAFF mRNA在NHL患者腫瘤組織中的表達(dá)［8］。國(guó)內(nèi)鞠少卿等［9］研究發(fā)現(xiàn)NHL患者外周血中BAFF蛋白水平并不高于正常對(duì)照，可能是由于所選血標(biāo)本已經(jīng)接受過(guò)藥物治療。因此，本次實(shí)驗(yàn)擬先在基因水平研究BAFF的表達(dá)變化，所選標(biāo)本均是未經(jīng)藥物治療的血標(biāo)本，即在患者入院時(shí)采集血標(biāo)本，隨即進(jìn)行分離提取RNA，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄檢測(cè) BAFFmRNA水平。研究結(jié)果顯示BAFF mRNA在NHL患者外周血中表達(dá)，且表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照組。說(shuō)明BAFF在NHL的發(fā)生、發(fā)展中可能起到一定的作用，值得進(jìn)一步的研究。

1 Moore P A，Belvedere O，Orr A et al．BLys:member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator ［J］．Science，1999;285:260－263．

2 Xu S，Lam K P．B cellmaturation protein，which binds the tumor necrosis factor familymembers BAFF and APRIL，is dispensable for humoral immune responses ［J］．Mol Cell Biol，2001;21:4067－4074．

3 Bossen C，Schneider P．BAFF，APRIL and their receptors:structure，function and signaling ［J］．Semin Immunol，2006;18(5):263－275．

4 Lied G A，Berstad A．Functional and clinical aspects of the B－cellactivating factor(BAFF):a narrative review ［J］．Scand JImmunol，2011;73(1):1－7．

5 Hong SD，Reiff A，Yang H T etal．B lymphocyte stimulator expression in pediatric systemic lupus erythematosus and juvenile idiopathic arthritis patients［J］．Arthritis Rheum，2009;60(11):3400－3409．

6 Ju S，Wang Y，Ni H et al．Correlation of expression levels of BLyS and its receptors with multiple myeloma［J］．Clin Biochem，2009;42:387－399．

7 Mariette X，Roux S，Zhang J et al．The level of BLyS(BAFF)correlates with the titre of autoantibodies in human Sjogren's syndrome［J］．Ann Rheum Dis，2003;62:168－171．

8 Novak A J，Grote D M，Stenson M etal．Expression of BLySand its receptors in B－cell non－Hodgkin lymphoma:correlation with disease activity and patient outcome［J］．Blood，2004;104:2247－2253．

9 鞠少卿，倪紅兵，王躍國(guó)et al．血清BLyS和APRIL水平與非霍奇金氏病關(guān)聯(lián)性的初步研究［J］．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2007;23(7):563－566．