攜人IL-12基因腺病毒的構(gòu)建及其對Hep3B細(xì)胞增殖及TGF-β表達(dá)的影響①

成 鳳 匡文斌 王 秦 秦曉林 范曉卿 董晉豫 梁勤東 李 樸 涂植光

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，重慶 400016)

IL－12是由單核巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等分泌的具有免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子，由P35和P40兩個(gè)亞基通過二硫鍵相連而成，P35、P40任何一個(gè)亞基單獨(dú)存在時(shí)沒有生物學(xué)活性，只有不同基因編碼的兩個(gè)亞基結(jié)合成異二聚體才具有生物學(xué)作用［1］。IL－12主要參與細(xì)胞免疫，能夠與NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，也能夠通過自身或誘導(dǎo)其它因子如IFN－γ抗腫瘤，在發(fā)現(xiàn)的早期就開始臨床應(yīng)用研究，成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)。但是全身應(yīng)用IL－12毒副作用大，而且半衰期短，制約了其在臨床的推廣應(yīng)用。因此，我們擬采用重組腺病毒作為基因治療的載體，將IL－12基因?qū)爰?xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)IL－12，發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究中首先構(gòu)建攜帶IL－12雙亞基基因的腺病毒載體，觀察其對人肝癌細(xì)胞Hep3B增殖及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF－β)表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究腫瘤免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack－CMV、骨架質(zhì)粒pAdEasy－1和大腸桿菌BJ5183由美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室何通川教授饋贈(zèng)。人胚腎293細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞Hep3B、大腸桿菌DH5α均由本室保存。LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。高保真酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等均購自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自O(shè)MEGA公司。鼠抗人IL－12單克隆抗體、鼠抗人β－actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記兔抗鼠二抗均購自Santa Cruz公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) AD293、Hep3B在37℃、5%CO2條件下，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)。

1．3 重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定 以pEGFPN1－IL12p40－p35 為模板，以 p1(CGGGGTACCGCCACCATGTGTCACCAGCAGTTGGTC，下劃線部分是KpnⅠ酶切位點(diǎn))、p2(CCGCTCGAGTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCATCA，下劃線部分是XhoⅠ酶切位點(diǎn))為引物，PCR擴(kuò)增IL－12 P40、P35雙亞基融合基因，產(chǎn)物以0．8%瓊脂糖凝膠電泳，回收融合目的基因。以 KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切 pAdTrack－CMV和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的DNA片段，用TaKaRa公司的T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，PCR確認(rèn)正確的質(zhì)粒再經(jīng)雙酶切鑒定，送TaKaRa測序。測序正確的穿梭質(zhì)粒命名為:pAdTrack－IL－12。

CaCl2法制備大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，將骨架質(zhì)粒pAdEasy－1轉(zhuǎn)化入BJ5183，挑取單克隆提取質(zhì)粒，將從BJ5183和DH5α中提取的 pAdEasy－1質(zhì)粒分別用 HindⅢ和 PstⅠ進(jìn)行單酶切，并用0．8%的凝膠電泳鑒定，觀察電泳條帶的差別，鑒定正確的克隆用CaCl2法制備感受態(tài) AdEasier cell。Pme Ⅰ單酶切穿梭質(zhì)粒 pAdTrack－IL－12，乙醇沉淀法回收線性化DNA，轉(zhuǎn)化AdEasier cell，卡那霉素平板培養(yǎng)20小時(shí)，挑取小菌落，提取質(zhì)粒，用PacⅠ酶切鑒定，用P1、P2 PCR鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為:pAd－IL－12。以同樣的方法構(gòu)建空載重組質(zhì)粒 pAd－EGFP。

1．4 重組腺病毒 pAd－IL－12的包裝及滴度測定PacⅠ單酶切重組質(zhì)粒pAd－IL－12，乙醇沉淀法回收線性化DNA。轉(zhuǎn)染前12小時(shí)將2×106個(gè)AD293細(xì)胞接種于25 cm2的組織培養(yǎng)瓶，按LipofectamineTM2000說明書的操作步驟，按3μg線性化DNA、15μl脂質(zhì)體(1∶5)的比例轉(zhuǎn)染，6小時(shí)后更換成含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基。48小時(shí)通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，了解轉(zhuǎn)染效果。每48小時(shí)觀察熒光及細(xì)胞病變情況，監(jiān)測病毒產(chǎn)量。12天后3 500 r/min、4℃離心10分鐘，收集細(xì)胞。37℃、80℃之間反復(fù)凍融4次，期間不斷渦旋，2 200 r/min、4℃離心5分鐘，收集含病毒顆粒的上清。

感染前20小時(shí)將AD293接種于培養(yǎng)瓶，融合至80%時(shí)進(jìn)行感染，3天后細(xì)胞病變脫落，收集細(xì)胞，連續(xù)擴(kuò)增3代。

感染前20小時(shí)將AD293接種于24孔板，融合至80%時(shí)進(jìn)行感染。用無血清培養(yǎng)基將病毒作10－2到10－13倍比稀釋，每一稀釋度重復(fù) 2 孔，24 小時(shí)后熒光顯微鏡(×100)下計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，計(jì)算病毒滴度。

1．5 重組腺病毒感染Hep3B及IL－12基因表達(dá)的情況 分別用重組腺病毒pAd－IL－12及空載腺病毒pAd－EGFP感染Hep3B，48小時(shí)后通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用引物 P1、P2進(jìn)行 PCR，檢測 IL－12基因mRNA水平的表達(dá)情況，并用 Western blot檢測IL－12蛋白表達(dá)情況。

1．6 表達(dá)IL－12對Hep3B細(xì)胞增殖的影響 收集對數(shù)期細(xì)胞，按6 000個(gè)細(xì)胞每孔接種細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，分為空白對照組、空載腺病毒組及pAd－IL－12組，加入相應(yīng)的病毒。分別于感染后0、24、48和72 小時(shí)每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸去培養(yǎng)液，于孔內(nèi)加入150μl二甲基亞砜，輕輕振蕩10分鐘，用酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測定各孔的吸光度值OD，每組3個(gè)復(fù)孔。

1．7 Hep3B細(xì)胞TGF－β 表達(dá)量的檢測 在 Gene－Bank查找TGF－β基因序列(NM_000660)，設(shè)計(jì)合成引物(TGF－F:CATCAACGGGTTCACTACC;TGFR:CTCCGTGGAGCTGAAGCA，擴(kuò)增166 bp片段)。重組腺病毒感染Hep3B 48后，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。設(shè)計(jì)內(nèi)參 β－actin 引物序列 β－actin－F:CTGGGACGACATGGAGAAAA;β－actin－R:AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC，擴(kuò)增564 bp片段。以cDNA作模板，TGF－F、TGF－R、β－actin－F、β－actin－R 為引物，PCR 檢測TGF－β及內(nèi)參β－actin表達(dá)。PCR條件:94℃ 30秒，60℃ 30 秒，72℃ 30 秒，35 cycles。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1．5%凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察攝像，用軟件Quantity One對電泳區(qū)帶掃描，計(jì)算各組目的基因TGF－β與內(nèi)參β－actin的灰度比值，再進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間差異采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16．0進(jìn)行方差分析，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定 利用引物P1和P2，以構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒 pAdTrack－IL－12為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過0．8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，長度約1．7 kb(圖1)。重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)雙酶切，可切下約1．7 kb的片段(圖1)，與理論相一致。測序結(jié)果與GeneBank比對，堿基序列完全吻合(圖略)。

從AdEasier cell和DH5α中提取的腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy－1分別用PstⅠ和HindⅢ酶切，得到完全相同的條帶(圖2)，說明AdEasier cell中的骨架質(zhì)粒未發(fā)生變化，可供進(jìn)行重組。

用PacⅠ酶切重組腺病毒質(zhì)粒可以看到一條4．5 kb的條帶(圖 3A);以 pAd－IL－12 為模板 PCR 擴(kuò)增得到1．7 kb的片段(圖3B)，說明成功構(gòu)建了IL－12重組腺病毒載體。

2．2 重組腺病毒的包裝及滴度測定 重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AD293，48小時(shí)觀察出現(xiàn)散在熒光;第7天出現(xiàn)成團(tuán)聚集的熒光，并能觀察到明顯的細(xì)胞病變，說明病毒包裝成功。4輪擴(kuò)增后得到1×1011滴度的病毒。

圖1 重組穿梭載體PCR、雙酶切鑒定結(jié)果Fig．1 PCR products and enzyme digestion maps of recombinant shuttle plasm id pAdTrack-IL-12

2．3 重組腺病毒感染Hep3B及IL－12基因表達(dá)的情況 腺病毒感染肝癌細(xì)胞后48小時(shí)，約90%的細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)(圖4)，說明對肝癌細(xì)胞Hep3B，腺病毒是很好的基因載體工具。

感染病毒 pAd－IL－12的肝癌細(xì)胞 RT－PCR 可以檢測到目的基因的表達(dá)(圖5)， Western blot在75 kD處有特異結(jié)合的條帶(圖6)，而空白組和空載組則沒有，說明重組腺病毒攜帶的目的基因在肝癌細(xì)胞中可以正常表達(dá)。

2．4 表達(dá)IL－12對Hep3B細(xì)胞增殖的影響 感染病毒pAd－IL－12組與兩對照組相比，Hep3B細(xì)胞增殖顯著抑制(P＜0．05);而空白對照組和空載組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P＞0．05，圖7)。

圖2 AdEasier cell鑒定Fig．2 Analysis pAdEasy-1 from AdEasier cell and DH5α

圖3 重組腺病毒質(zhì)粒pAdTrack-IL-12 PacⅠ酶切鑒定(A)和PCR鑒定(B)Fig．3 Identification of recombinant adenoviral plasm ids with PacⅠdigestion(A)and PCR(B)

2．5 檢測Hep3B細(xì)胞TGF－β的表達(dá)量 計(jì)算目的基因TGF－β與β－actin灰度值的比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與對照組(TGF－β/β－actin:0．37)相比，pAd－IL－12 感染組(TGF－β/β－actin:0．22)TGF－β 的表達(dá)量降低(P＜0．05);而空白對照組和空載組(TGF－β/β－actin:0．36)沒有明顯差異(P ＞0．05，圖8)。

3 討論

白介素12具有多種抗腫瘤相關(guān)生物學(xué)功能［2］，如促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫;促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的活化、增殖，并增強(qiáng)其細(xì)胞毒性;誘導(dǎo)細(xì)胞因子特別是IFN－γ的合成與分泌，通過α－趨化因子及 IFN－γ誘生蛋白10(IP－10)抑制腫瘤血管生成，是腫瘤免疫治療常用的細(xì)胞因子［3］。

臨床試驗(yàn)中IL－12的腫瘤治療作用得到了證實(shí)，但是重組人IL－12全身用藥可導(dǎo)致一些毒副作用［4，5］，而且半衰期短，停藥后作用迅速消失［6］，所以局部應(yīng)用Il－12，特別是利用分子生物學(xué)技術(shù)內(nèi)源性表達(dá)IL－12，穩(wěn)定產(chǎn)生IL－12成為新途徑。現(xiàn)在常用的方法有瘤內(nèi)注射IL－12、病毒載體、脂質(zhì)體或電穿孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、水流動(dòng)力學(xué)注射質(zhì)粒等，我們選擇了重組腺病毒。相較于其它方法，腺病毒具有滴度高、穩(wěn)定、不整合宿主基因組、給藥方便、感染范圍廣、安全的優(yōu)點(diǎn)，并已被美國FDA批準(zhǔn)作為基因治療載體用于臨床試驗(yàn)。

轉(zhuǎn)化生長因子 β(Transforming growth factor－β，TGF－β)是一種能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化的多功能多肽超家族。TGF－β與腫瘤的關(guān)系非常復(fù)雜［7］，在腫瘤發(fā)展的早期，TGF－β抑制腫瘤生長;而腫瘤進(jìn)展過程中TGF－β促進(jìn)血管形成、促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、抑制免疫反應(yīng)從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。隨著研究的不斷深入，TGF－β已經(jīng)成為腫瘤防治的靶基因［8］。實(shí)驗(yàn)證明，利用TGF－β單克隆抗體或者反義mRNA下調(diào)TGF－β，表現(xiàn)出抗腫瘤的作用。有研究表明IL－12和IFN－γ可以抑制TGF－β的表達(dá)，并且在自身免疫性疾病的治療中起到重要作用［9］，但是在腫瘤治療中關(guān)于IL－12和TGF－β的關(guān)系尚無報(bào)道。

文獻(xiàn)報(bào)道，TGF－β對腫瘤細(xì)胞的作用有細(xì)胞特異性［10］。對于Hep3B細(xì)胞，其表現(xiàn)為雙向性作用:應(yīng)用外源性 TGF－β 可以誘導(dǎo) Hep3B 凋亡［11］，但TGF－β高表達(dá)的 Hep3B細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤治療抵抗［12］，Shin 等［13］也證實(shí)腫瘤治療藥物他莫昔芬抑制Hep3B表達(dá)TGF－β從而抑制腫瘤生長。

本研究中我們成功構(gòu)建了攜人IL－12基因的重組腺病毒，構(gòu)建的重組腺病毒pAd－IL－12能高效感染Hep3B，并在 mRNA、蛋白水平高表達(dá) IL－12。高效的基因遞送系統(tǒng)是基因治療的基礎(chǔ)，我們構(gòu)建的腺病毒對Hep3B有很好的感染及靶基因表達(dá)效率，說明對Hep3B而言，腺病毒是很好的基因運(yùn)載工具。研究中還發(fā)現(xiàn)，在人肝癌細(xì)胞株Hep3B中，內(nèi)源性高表達(dá) IL－12可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并伴有TGF－β的表達(dá)的下調(diào)，提示高表達(dá) IL－12抑制Hep3B細(xì)胞增殖的機(jī)制可能涉及下調(diào)TGF－β的表達(dá)。但由于前述IL－12和TGF－β對腫瘤細(xì)胞作用的復(fù)雜性，IL－12與TGF－β表達(dá)、Hep3B生長調(diào)控的確切關(guān)系尚需進(jìn)一步探討。

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