前額葉切除對沙鼠學(xué)習(xí)與記憶和海馬CA1區(qū)膽堿能神經(jīng)元的影響

王貴振 李建民 史 強 范衛(wèi)慶

(山東省新泰市人民醫(yī)院神經(jīng)外科 山東 新泰 271200;①河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

學(xué)習(xí)、記憶是人腦的重要功能之一。通過功能核磁共振成像的研究發(fā)現(xiàn)，前額葉皮質(zhì)在工作記憶的過程中發(fā)揮著很重要的作用。大腦海馬區(qū)與大腦皮層(前額葉)的臨時信息交流，對于記憶的形成與儲存起關(guān)鍵作用，在兩個區(qū)域的信息交流過程中，大腦皮層神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)也做出相應(yīng)的調(diào)整。海馬的結(jié)構(gòu)、解剖學(xué)位置以及纖維聯(lián)系的特點，都提示它可能在學(xué)習(xí)和記憶中起重要作用。為了證實前額葉皮質(zhì)在學(xué)習(xí)記憶中的作用，我們制作了前額葉皮質(zhì)切除沙鼠模型，并觀察術(shù)后海馬CA1區(qū)形態(tài)變化，進(jìn)一步探討海馬及前額葉在學(xué)習(xí)記憶中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制作 選取29只健康蒙古沙土鼠(購于浙江省實驗動物中心)，清潔級，體質(zhì)量60～80g，雌性，9～12周齡。將其隨機分成正常對照組、假手術(shù)組、前額葉切除7天組和前額葉切除21天組。假手術(shù)組暴露前額葉。按參考文獻(xiàn)[1]報道的方法制作前額葉皮質(zhì)切除模型。在(22±1)℃環(huán)境溫度下，將沙鼠予3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于立體定向儀上。切開頭皮，暴露顱骨，在冠狀縫前1.0mm、矢狀縫旁開2mm處用顯微磨鉆鉆1個小骨窗，用顯微持針器擴大骨窗。用自制吸引器吸除冠狀縫前約1.0mm至額極的右側(cè)額葉背外側(cè)皮質(zhì)，作1個4mm×3mm×1mm大小的創(chuàng)腔，用明膠海綿填塞止血后縫合頭皮。各組動物在手術(shù)完成7天或21天后進(jìn)行4－PTT旱路迷宮實驗，測試學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 取迷宮實驗完成后動物前囟后2.5～4.0mm之間的大腦部分進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片行H－E染色。海馬神經(jīng)元損傷的評價:在Olympus光鏡下觀察海馬CA1區(qū)錐體層細(xì)胞形態(tài)變化并計數(shù)單位高倍視野(400×)下的神經(jīng)元數(shù)，即神經(jīng)元密度(Neuronal density，ND)。我們在左右兩側(cè)海馬各任取3個高倍視野(400×)記數(shù)，取平均值。

1.3 膽堿能神經(jīng)元觀察 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。按試劑盒說明行CHAT免疫組化染色。在顯微鏡下計數(shù)兩側(cè)海馬CA1區(qū)各3個高倍視野(400×)范圍內(nèi)的CHAT陽性細(xì)胞并取平均值。

1.4 4－PTT旱路迷宮實驗 4－PTT旱路迷宮是日本山形大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)機能研究室與華北煤炭醫(yī)學(xué)院聯(lián)合研制開發(fā)的評價學(xué)習(xí)記憶能力的實驗裝置(主要用于評價不悉水性的蒙古沙鼠)，通過記錄沙鼠自然環(huán)境下進(jìn)入迷宮的攝食情況，可以同時測試動物的活動狀況、緊張狀態(tài)、行動反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶等情況。本實驗主要采用的檢測指標(biāo)為:①達(dá)到完成標(biāo)準(zhǔn)所需的實驗次數(shù)(tests of reaching completing standard，TRSC);②每次完成實驗所用的 時間(t time of completing three pellets，TCFP);③每次實驗中從開始到吃掉第1個食丸所用的時間 (time of completing first pellet，TCTP);④每次實驗中的正確錯誤數(shù)(correct error CE)。指標(biāo)①、②、③主要觀察動物通過訓(xùn)練后能正確完成實驗的情況，反映動物參照記憶的形成，指標(biāo)④主要觀察動物進(jìn)入無食物盒次數(shù)、重復(fù)進(jìn)入已吃掉食物食盒次數(shù)，反映動物工作記憶的形成[2]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SAS8.20版統(tǒng)計軟件包進(jìn)行完全隨機設(shè)計的方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶測試結(jié)果 前額葉皮質(zhì)切除7天組和21天組各學(xué)習(xí)記憶指標(biāo)均差于假手術(shù)組，差異有顯著性(P＜0.05)，說明前額葉切除使沙鼠的學(xué)習(xí)記憶受到損害。前額葉皮質(zhì)切除21天組各學(xué)習(xí)記憶指標(biāo)均差于7天組，差異有顯著性(P＜0.05)，說明前額葉皮質(zhì)切除后隨著時間的延長，學(xué)習(xí)記憶的損害加重。見表1。

2.2 病理結(jié)果(HE染色) 顯微鏡觀察前額葉損傷組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元部分變性壞死，細(xì)胞間隙加大，空泡樣變，部分細(xì)胞核濃縮、深染，溶解、消失。

2.3 CHAT免疫組織化學(xué)結(jié)果 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)正常對照組和假手術(shù)組沙鼠海馬CA1區(qū)陽性膽堿能神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊致密，可見2～3層細(xì)胞，細(xì)胞核染色淡，核仁清晰，胞漿染成深棕色，未見明顯變性壞死的神經(jīng)元。見圖1。前額葉切除組可見海馬CA1區(qū)陽性膽堿能神經(jīng)元排列稀疏，胞漿染成淺棕色，可見變性壞死的神經(jīng)元。見圖2和表2。

表1 各組工作記憶與參照記憶的比較()

表1 各組工作記憶與參照記憶的比較()

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與前額葉切除7天組比較，▲P＜0.05

組別 例數(shù) TRCS(次數(shù)) TCFP(s) TCTP(s) CE(次數(shù))2.3 ±0.5 40.8 ±10.7 99.0 ±14.1 2.0 ±0.7假手術(shù)組 6 2.6 ±0.5 34.2 ±12.7 104.7 ±20.5 2.2 ±1.3前額葉切除7 天組 8 5.0 ±0.9* 90.3 ±11.9* 209.3 ±53.6* 5.3 ±2.4*前額葉切除21天組 8 7.0±1.0＊▲ 119.8±20.4＊▲ 274.8±55.8＊▲ 8.4±2.2正常對照組7＊▲

表2 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度與陽性膽堿能神經(jīng)元的比較()

表2 各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度與陽性膽堿能神經(jīng)元的比較()

注:與對照組比較，*P＜0.05;與前額葉切除組比較，#P＜0.05

正常對照組7 32.6 ±2.6 27.3 ±1.9假手術(shù)組 6 33.2 ±2.5 26.3 ±2.2前額葉切除7 天組 8 24.2 ±3.0* 20.8 ±1.9*前額葉切除21 天組 8 20.6 ±1.6*# 17.8 ±2.2*#

圖1 對照組海馬CA1區(qū)CHAT染色陽性膽堿能神經(jīng)元的顯微鏡下變化(免疫組化400×)

圖2 前額葉切除21天組海馬CA1區(qū)CHAT染色陽性膽堿能神經(jīng)元的顯微鏡下變化(免疫組化400×)

3 討論

前額葉皮層是個體發(fā)育中最遲成熟的大腦新皮層，是所有皮層中功能最復(fù)雜、了解最少的部位[3]?，F(xiàn)在大多數(shù)研究認(rèn)為前額葉皮層在工作記憶中起著關(guān)鍵作用，尤其是執(zhí)行控制功能。執(zhí)行控制具體化的兩個最基礎(chǔ)方面是:①注意與抑制;②任務(wù)管理[4]。在 fMRI研究中[5～7]，前額葉皮層在這兩個學(xué)習(xí)記憶過程中均可觀察到明顯激活。這些都說明前額葉皮層在工作記憶中起著極其重要的作用。乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)是第1個被發(fā)現(xiàn)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)。中樞膽堿能遞質(zhì)在學(xué)習(xí)與記憶中有重要的調(diào)節(jié)作用，保持其功能正常，是維持哺乳動物學(xué)習(xí)記憶正常進(jìn)行的必要條件[8]。大腦新皮質(zhì)和海馬之間也有廣泛的膽堿能纖維的相互聯(lián)系。膽堿乙?；?CHAT)在膽堿能神經(jīng)元胞體內(nèi)合成，是膽堿能神經(jīng)元的特殊標(biāo)志。前額葉皮質(zhì)切除2周后，就可見到海馬CA1區(qū)的膽堿能神經(jīng)元減少。且4周后膽堿能神經(jīng)元進(jìn)一步減少，與學(xué)習(xí)記憶的損害相平行。前額葉皮質(zhì)切除后學(xué)習(xí)記憶的損害可能與前額葉皮質(zhì)膽堿能神經(jīng)元的直接缺失和海馬CA1區(qū)膽堿能神經(jīng)元的遲發(fā)性壞死相關(guān)。而吳佐泉[9]也報道損傷前額葉可導(dǎo)致基底前腦膽堿能神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，這可能是學(xué)習(xí)記憶發(fā)生遲發(fā)性損害的一個原因。因為膽堿能神經(jīng)元釋放的遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)在學(xué)習(xí)記憶過程中起著重要作用，而皮質(zhì)膽堿能神經(jīng)元的直接缺失和海馬CA1區(qū)膽堿能神經(jīng)元的遲發(fā)性壞死導(dǎo)致了乙酰膽堿分泌不足。乙酰膽堿分泌不足導(dǎo)致了相關(guān)功能的障礙。通過制作沙鼠前額葉皮質(zhì)切除模型，證實產(chǎn)生了學(xué)習(xí)記憶的損害，為以后益智類藥物的測試及學(xué)習(xí)記憶機制的研究等提供一種新的途徑。當(dāng)然此模型還需進(jìn)一步驗證和完善。

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