體外分離子宮內(nèi)膜干細(xì)胞3種方法的比較*

郭玉琪，趙瀟丹，路 平，張 展

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科鄭州450052

目前，可以通過(guò)體外培養(yǎng)獲得大量的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，通過(guò)介入途徑、局部種植和靜脈途徑等方法來(lái)治療子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病［1］，特別是由于子宮內(nèi)膜過(guò)薄、生長(zhǎng)不良等原因?qū)е碌氖芫褵o(wú)法著床或子宮內(nèi)膜容受性差等原因?qū)е碌牟辉校瑸橐蜃訉m內(nèi)膜相關(guān)原因不孕患者提供了一種新的治療方法。雖然國(guó)內(nèi)外研究者［2-3］已探索出多種分離子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的方法，然而，目前還未建立標(biāo)準(zhǔn)的體外分離、培養(yǎng)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的方法，也未建立合適的體外培養(yǎng)條件。該研究旨在尋找一種比較簡(jiǎn)便、實(shí)用、高效的體外分離、培養(yǎng)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的方法，為進(jìn)一步從細(xì)胞和分子水平研究子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的各種功能及其干預(yù)調(diào)節(jié)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PBS 液(無(wú) Ca2+、Mg2+)、2.5 g/L胰蛋白酶(上海泛柯生物科技有限公司)，膠原酶Ⅰ(美國(guó)Invitrogen公司)，胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，青鏈霉素溶液(魯抗制藥廠生產(chǎn))，臺(tái)盼蘭染色液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、DAB顯色試劑盒、CD90抗體和CD146抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 標(biāo)本來(lái)源和處理 選取2010年3月至5月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，因子宮肌瘤、子宮脫垂、原位宮頸癌等而進(jìn)行子宮切除手術(shù)的患者，年齡31～49歲。術(shù)前3個(gè)月未使用過(guò)任何激素。術(shù)后立即取材，在子宮體后壁、距宮底1～2 cm處，無(wú)菌剃取子宮內(nèi)膜組織并包括5 mm的子宮肌層。用PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，直到液體清亮。移入含雙抗的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)送至超凈工作臺(tái)。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將所取患者的子宮內(nèi)膜標(biāo)本平均分為3份，分別放在3個(gè)培養(yǎng)皿中，分別采用不同的方法進(jìn)行消化分離。

1.3 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

1.3.1 細(xì)胞的分離 ①方法A:采用胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化。把新鮮子宮內(nèi)膜組織剪碎，置于含2.5 g/L胰蛋白酶中，37 ℃振蕩消化20～30 min，加人含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的D/F12培養(yǎng)基終止消化，并用Pasteur吸管反復(fù)抽吸、吹打，對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行機(jī)械消化。②方法B:采用膠原酶Ⅰ對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化。在剪碎的子宮內(nèi)膜組織中加入膠原酶Ⅰ，使其分離為單細(xì)胞懸液，37℃消化50～60 min。將消化好的細(xì)胞懸液吸入離心管中，靜置以去除未完全消化的大塊組織，然后1 200 r/min離心5 min取上清。③方法C:采用混合消化細(xì)胞法進(jìn)行操作。將取出的子宮內(nèi)膜組織置于冰上，PBS洗滌并剔除血塊，剪成小于1 mm3的小塊(肉眼呈糊狀)后加入2 g/L膠原酶Ⅰ(膠原酶與組織體積比為5∶1)，吹打混勻后，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中消化1 h，30 min時(shí)取出吹打1次。然后加入胰蛋白酶，吹打混勻后繼續(xù)消化20 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入D/F12培養(yǎng)基洗滌后，用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液經(jīng)1 000 r/min離心5 min，收集沉淀。

1.3.2 細(xì)胞的接種和培養(yǎng) 分離得到的細(xì)胞洗滌后，用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，按照5×108L－1的細(xì)胞密度接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、D/F12和青鏈霉素溶液的25 cm2的培養(yǎng)瓶中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育。24 h后換液，棄除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。嚴(yán)密觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞生長(zhǎng)約14 d左右鋪滿培養(yǎng)瓶底，即可進(jìn)行傳代，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入2.5 g/L胰蛋白酶1 mL消化2～3 min，鏡下見(jiàn)細(xì)胞收縮變圓，立即加入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的D/F12培養(yǎng)基，終止消化，并反復(fù)用吸管取瓶底液吹打成為細(xì)胞懸液后移入15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清后再次加入含胎牛血清的D/F12培養(yǎng)液6 mL，按1∶2傳代的比例分成2個(gè)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 取第2代細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種 1 mL，細(xì)胞密度為 1.5 ×1010L－1，將培養(yǎng)板置于CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置密閉培養(yǎng)。每日計(jì)數(shù)3孔，取平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 細(xì)胞鑒定

1.5.1 CD90和CD146蛋白檢測(cè) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)。取第2代細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化后按1×109L－1的密度接種于載玻片上，待細(xì)胞爬滿載玻片后，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min;PBS清洗;體積分?jǐn)?shù)3%H2O2處理10 min，正常血清工作液封閉10 min，加入一抗(按1∶100稀釋)于載玻片上(37℃，2 h);PBS清洗后加入二抗(37℃，0.5 h);DAB顯色2～6 min;蘇木素復(fù)染2～6 min;樹(shù)膠封閉固定;顯微鏡下觀察。以胞核或胞質(zhì)呈淡黃色至深棕黃色為CD90和CD146陽(yáng)性細(xì)胞，顯色強(qiáng)度與背景無(wú)明顯差別者為陰性。高倍鏡(×400)下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞百分比＞90%為培養(yǎng)成功。

1.5.2 CD90和 CD146 mRNA的檢測(cè) 取第2代細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化后，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS吹打混成細(xì)胞懸液后備用。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA后，進(jìn)行 PCR反應(yīng)。CD90引物序列為:上游5’-TAGTGGACCAGAGCCTTCG-3’，下 游 5’-GTTCGG GAGCGGTATGTG-3’，擴(kuò) 增 片 段 大 小 150bp。CD146引物序列為:上游 5’-ACCAGGGAGGCA GAGGAA-3’，下 游 5’-TGACGCTTCACAAGACA GATT-3’，擴(kuò)增片段大小500 bp。內(nèi)參β-actin引物序列為:上游 5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’，下游 5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’，擴(kuò)增片段大小564 bp。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán);72℃總延伸6 min。PCR結(jié)果采用EB染色，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用大連Jim-X Scientific D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 3種分離子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的效果比較 消化后的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)均得到形態(tài)一致的細(xì)胞，3種方法組織消化時(shí)間、活細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞貼壁時(shí)間和細(xì)胞純度的比較見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，方法B分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞具有一定的優(yōu)勢(shì)，活細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞貼壁較牢，細(xì)胞純度高，雜質(zhì)少。

2.2 方法B分離、培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶24～48 h后貼壁生長(zhǎng)，3 d后大約可見(jiàn)細(xì)胞有細(xì)小突起自邊緣爬出。7～9 d可以長(zhǎng)滿25 cm2的培養(yǎng)瓶。倒置顯微鏡下可見(jiàn)到:少量細(xì)胞為多角形，有多個(gè)短小細(xì)胞突出，胞質(zhì)薄而透明，核圓居中，細(xì)胞排列無(wú)極性，平鋪生長(zhǎng)。大多細(xì)胞為梭形，具有成纖維細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)豐富，核橢圓(圖1)。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的比較 3種方法所得的第2代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖相似，均為近似的“S”形(圖2)，有明顯的滯留期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。

表1 3種細(xì)胞分離方法的比較

2.4 方法B培養(yǎng)第2代細(xì)胞CD90和CD146的表達(dá) 見(jiàn)圖3，CD90和CD146蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞均＞90%。RT-PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 第2代細(xì)胞CD90(A)和CD146(B)蛋白的表達(dá) (SP，×400)

圖4 第2代細(xì)胞CD90(上)和CD146(下)mRNA的表達(dá)

3 討論

該實(shí)驗(yàn)將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，可以更好地發(fā)揮二者的協(xié)同作用，更加真實(shí)的模擬體內(nèi)環(huán)境，利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。作者采用3種方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化培養(yǎng)。方法A用胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，優(yōu)點(diǎn)為消化時(shí)間短，但細(xì)胞損傷較大，消化后細(xì)胞懸液黏度大，細(xì)胞不易分離，細(xì)胞純度不高，活細(xì)胞數(shù)量較低，生長(zhǎng)緩慢，貼壁不牢。方法B用膠原酶Ⅰ消化細(xì)胞，消化后細(xì)胞活率高，細(xì)胞的純度高，細(xì)胞易于貼壁，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。方法C為混合消化法，消化時(shí)間介于前兩者之間，細(xì)胞經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾后，純度較高，但細(xì)胞數(shù)量丟失較多，篩網(wǎng)反復(fù)過(guò)濾，增加了操作步驟同時(shí)也增加了細(xì)胞污染的機(jī)會(huì)，因此操作要求非常嚴(yán)格?？梢钥闯觯媚z原酶Ⅰ法分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞具有一定的優(yōu)勢(shì)，這可能是因?yàn)?膠原酶是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。

由于目前尚無(wú)特異性標(biāo)記的抗體用于子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的鑒別［4］，所以該實(shí)驗(yàn)選取造血干細(xì)胞的主要標(biāo)志 CD90［5］和間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物 CD146［6］，采用RT-PCR方法和免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明采用方法B培養(yǎng)的細(xì)胞CD90和CD146蛋白及mRNA有表達(dá)，具有子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的特性。

［1］Meng X，Ichim TE，Zhong J，et al.Endometrial regenerative cells:a novel stem cell population［J］.J Transl Med，2007，5:7A

［2］Musina RA，Belyavski AV，Tarusova OV.Endometrial mesenchymal stem cells isolated from the menstrual［J］.Blood，2008，45(4):539

［3］Li L，Xie T.Stem cell niche:structure and function［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2005，21(3):605

［4］習(xí)佳飛，王韞芳，裴雪濤.成體干細(xì)胞及其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［J］.生命科學(xué)，2006，8(4):328

［5］Meng X，Ichim TE，Zhong J，et al.Endometrial regenerative cells:a novel stem cell population［J］.J Trans Med，2007，15(5):57

［6］Schwab KE，Gargett CE.Co-expression of two perivascular cell markers isolates mesenchymal stem-like cells from human endometrium［J］.Hum Reprod，2007，22(11):2903