高效液相色譜法測(cè)定人血漿中蘆氟沙星血藥濃度方法的改進(jìn).

慕楊娜 李國信 夏素霞 魏曉明

（1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，沈陽110034；2沈陽億靈醫(yī)藥科技有限公司，沈陽110179）

高效液相色譜法測(cè)定人血漿中蘆氟沙星血藥濃度方法的改進(jìn).

慕楊娜1李國信1夏素霞1魏曉明2

（1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，沈陽110034；2沈陽億靈醫(yī)藥科技有限公司，沈陽110179）

目的建立測(cè)定人血漿中蘆氟沙星濃度的高效液相色譜法（HPLC），并應(yīng)用于人體藥動(dòng)學(xué)研究。方法以左氧氟沙星為內(nèi)標(biāo)，待測(cè)血漿用二氯甲烷萃取后，采用Plastisil ODS色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），以0.057mol?L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液:乙腈[84:16，用磷酸調(diào)pH至（3.50±0.01）]為流動(dòng)相，檢測(cè)波長297nm，流速1.2ml/min。結(jié)果血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定；蘆氟沙星在0.0250～5.0025μg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.0250μg?mL-1。提取回收率為68.6%～73.5%。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，適用于人血漿中蘆氟沙星的測(cè)定。

蘆氟沙星；HPLC；藥動(dòng)學(xué)

鹽酸蘆氟沙星（Rufloxacin）是新一代喹諾酮類廣譜抗菌藥，對(duì)革蘭陰性菌具良好抗菌作用，包括大腸埃希菌、傷寒沙門菌、志賀菌屬、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌等均具有較強(qiáng)的抗菌活性。對(duì)葡萄球菌屬、溶血性鏈球菌等革蘭陽性球菌也有一定的抗菌作用。文獻(xiàn)[1-4]中報(bào)道蘆氟沙星的定量下限最低為0.04μg?mL-1，本文建立了一種快速，簡便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高的高效液相色譜法檢測(cè)血漿中蘆氟沙星的濃度，定量下限可達(dá)0.0250μg?mL-1，提高了檢測(cè)的靈敏度，適用于蘆氟沙星的藥動(dòng)學(xué)研究及血藥濃度監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥LC-10ATvp型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SPD-10Avp紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；LC Solution Lite色譜工作站軟件（日本島津公司）。

鹽酸蘆氟沙星原料藥（含量99.1%，批號(hào)：100503，本公司自制）；左氧氟沙星對(duì)照品（含量97.3%，批號(hào)：130455-201005，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈、甲醇（均為山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司產(chǎn)品，色譜純）；氫氧化鈉、二氯甲烷（均為天津市博迪化工有限公司產(chǎn)品，分析純）；磷酸二氫鉀（廣東汕頭市西隴化工廠，分析純）；磷酸（沈陽經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)試劑廠，分析純）；試驗(yàn)藥物：Mediolanum Farmaceutici S.p.A生產(chǎn)的鹽酸蘆氟沙星片（0.2g/片）。

1.2 色譜條件色譜柱：Plastisil ODS柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.057mol/L磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈[84:16，用磷酸調(diào)pH至（3.50±0.01）]；流速1.2ml?min-1；檢測(cè)波長為297nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為50μl。

1.3 蘆氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液配制精密稱取鹽酸蘆氟沙星原料藥22.52mg（相當(dāng)于蘆氟沙星約20.01 mg），置100ml量瓶中，用0.1mol?L-1NaOH溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為200.1μg?mL-1的蘆氟沙星儲(chǔ)備液；再以0.1mol?L-1NaOH溶液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2500，1.0005，2.0010，5.0025，10.0050，20.0100，50.0250μg?mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取左氧氟沙星對(duì)照品10.36mg（相當(dāng)于左氧氟沙星約10.08 mg），置100ml量瓶中，用甲醇-水（1:1）溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為100.8μg?mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；精密量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液2.0ml，置50ml量瓶中，用甲醇:水（1:1）稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為4.0320μg?mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4 血漿樣品處理方法取血漿樣品500μl置10ml離心管中，加入0.1mol?L-1NaOH溶液50μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液（4.0320μg?ml-1左氧氟沙星溶液）50μl，渦旋30s混勻后，加入提取溶劑二氯甲烷3ml，往復(fù)振蕩8min（8檔），10000r?min-1離心6min，取有機(jī)溶劑層置5ml離心管中，于40℃水浴中，空氣流吹干，殘留物用流動(dòng)相300μl復(fù)溶，渦旋1min，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，15000r?min-1離心5min，取上清液50μl進(jìn)樣分析。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)24名健康男性志愿者經(jīng)詢問病史及心電圖、肝、腎功能等檢查均正常。24名受試者均無煙酒嗜好，試驗(yàn)前10d及試驗(yàn)期間未服用任何藥物。于試驗(yàn)前向本人說明試驗(yàn)?zāi)康?、藥物特性、臨床應(yīng)用范圍及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，并由受試者簽署知情同意書。試驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者禁食過夜至少10h后，空腹將1片試驗(yàn)藥物（0.2g/片）用250ml溫開水送服，服藥后2h可飲水，4h后統(tǒng)一進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)餐。分別于給藥前及給藥后0.5，1.00，1.50，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00，12.0，24.0，48.0，72.0，108，144h取靜脈血，每一階段總計(jì)取15個(gè)點(diǎn)（每點(diǎn)取血5ml，嚴(yán)格避光），置肝素抗凝試管中，采集的血液樣品立即離心（3500rpm，4℃離心10min），分離血漿。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察蘆氟沙星和內(nèi)標(biāo)左氧氟沙星的保留時(shí)間分別為9.9min和11.9min，蘆氟沙星以及內(nèi)標(biāo)左氧氟沙星分離良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，色譜圖見圖1。

圖1 血漿中蘆氟沙星及內(nèi)標(biāo)左氧氟沙星色譜圖

2.2 線性關(guān)系及定量下限取空白血漿500μl，分別加入蘆氟沙星標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50μl，配制血漿中蘆氟沙星質(zhì)量濃度為0.0250，0.1001，0.2001，0.5003，1.0005，2.0010，5.0025μg?mL-1的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下方法操作，制備蘆氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行雙樣本分析。以蘆氟沙星濃度（μg?mL-1）為橫坐標(biāo)X，蘆氟沙星與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（As/Ai）為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法[5]（權(quán)重系數(shù)：1/X2）進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得的線性回歸方程為Y=0.00217X+ 0.00468，r=0.999 5；結(jié)果表明，蘆氟沙星在0.0250～5.0025μg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.0250μg?mL-1（S/N＞10）。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度精密量取空白血漿500μl，分別加入不同濃度的蘆氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl，配制成血漿中蘆氟沙星質(zhì)量濃度為0.0500，0.8004和4.0020μg?mL-1的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)制備并測(cè)定3d，每天分為低、中、高3個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度進(jìn)行6樣本分析，計(jì)算血漿樣品中蘆氟沙星的濃度，求得方法的精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的高效液相色譜法測(cè)定的準(zhǔn)確度和批內(nèi)、批間精密度均達(dá)到試驗(yàn)要求。計(jì)算批內(nèi)和批間的精密度（RSD），結(jié)果見表2。

表2 精密度以及準(zhǔn)確度

2.4 提取回收率的考察精密量取空白血漿500μl，分別加入不同濃度的蘆氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl，配制成血漿中蘆氟沙星質(zhì)量濃度為0.0500，0.8004和4.0020μg?mL-1的質(zhì)控樣品（QC），每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行6樣本分析，將各色譜峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積比較，計(jì)算本方法提取回收率，蘆氟沙星低、中、高3個(gè)濃度的回收率分別為（68.6±3.6）%，（73.2±3.9）%和（73.5±10.2）%，內(nèi)標(biāo)回收率為（79.0 ±6.5）%。

2.5 樣品的穩(wěn)定性按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為0.0500和4.0020μg?mL-1的對(duì)照品血漿樣品各21份。分別考察其在室溫、凍融循環(huán)以及處理后樣品在室溫條件下和冷凍條件下的穩(wěn)定性，當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣品中蘆氟沙星的濃度，將測(cè)定濃度的平均值與理論濃度對(duì)照,所有測(cè)定結(jié)果偏差都在±15%以內(nèi)，表明血漿樣品在室溫放置6h、血漿樣品處理復(fù)溶后室溫放置25h、血漿樣品提取吹干后冷凍放置49h、血漿樣品3次冷凍-解凍循環(huán)條件下穩(wěn)定性良好。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究健康受試者單劑量口服0.2g鹽酸蘆氟沙星片后，試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Phoenix WinNonlin 6.0軟件處理，得到蘆氟沙星的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別為t1/2：（38.014± 9.097）h、Cmax：（1.931±0.312）μg?mL-1、Tmax：（1.404± 0.478）h、AUC0-t：（72.589±13.741）h*μg?mL-1、AUC0-∞：（77.193±12.321）h*μg?mL-1。

3 討論

本文建立了一種快速、簡便、靈敏的HPLC法測(cè)定人血漿中蘆氟沙星的濃度。文獻(xiàn)[3]中報(bào)道的定量下限最低為0.04μg?mL-1，在本實(shí)驗(yàn)條件下，定量下限可達(dá)到0.0257μg?mL-1，提高了檢測(cè)的靈敏度。

文獻(xiàn)中報(bào)道的樣品處理方法多為堿化后用二氯甲烷進(jìn)行兩次提取[1-2]，或沉淀蛋白法[3]，本文采用0.1mol?L-1NaOH溶液進(jìn)行堿化，使蘆氟沙星在溶液中處于游離狀態(tài)，再用二氯甲烷進(jìn)行提取，此方法操作簡便，提取回收率高且穩(wěn)定，適用于大批量樣品處理的藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究。

本文嘗試以氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星及左氧氟沙星為內(nèi)標(biāo)，其中左氧氟沙星峰形較好，出峰時(shí)間較早，回收率高且穩(wěn)定，與內(nèi)源性物質(zhì)分離良好，因此最終選定左氧氟沙星為內(nèi)標(biāo)。

[1]吳勝林,羅俊鴻,何同勝.蘆氟沙星膠囊的人體藥動(dòng)學(xué)研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2003,22(10):676-678.

[2]張先洲,潘細(xì)貴,羅順德.高效液相色譜法測(cè)定人血漿中的蘆氟沙星[J].色譜,2000,18(2):175-177.

[3]江立富,鄭誼,馬亞平.高效液相色譜法測(cè)定血清中蘆氟沙星及藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),1999,15(6):33-34.

[4]蔣維,梁德榮,梁茂植.國產(chǎn)蘆氟沙星人體藥代動(dòng)力學(xué)與生物利用度研究[J].中國抗生素雜質(zhì),1999,24(5):377-380.

[5]鐘大放.以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的若干問題[J].藥物分析雜志,1996,16(5):343-346.

HPLC Improvement on Determining Human Plasma Concentration of Rufloxacin

Mu Yangna1Li Guoxin1Xia Suxia1Wei Xiaoming2
(1.LaboratoryofClinicalPharmacology,AcademeofTraditionalChineseMedicineofLiaoningProvince,Shenyang110034,China;2.E?livingpharmaceuticalcoLtdShenyang110034,China)

ObjectiveTo develop a HPLC method for determination of rufloxacin in human plasma.The pharmacokinetics in human was also investigated.MethodsPlasma was extracted by dichloromethane using levofloxacin as internal standard and then separated on a Plastisil ODS（250mm×4.6mm,5μm）column using 0.057 mol?L-1potassium dihydrogen phosphate-acetonitrile（84:16,adjusted pH to 3.50±0.01 with phosphoric acid）as mobile phase.The detection wavelength was 297 nm.The flow rate was 1.2ml?min-1.ResultsThe assay had a calibration range from 0.0250 to 5.0025μg?mL-1and lower limit of quantification(LLOQ)was 0.0257 μg?mL-1for rufloxacin.The recovery of rufloxacin was 75.6%～77.7%.ConclusionThe method was shown to be simple,accurate,sensitive and specific which is suitable for determination of Rufloxacin in human plasma.

Rufloxacin;HPLC;Pharmacokinetics

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.05.112

1672-2779（2012）-05-0160-02

：蘇玲

2012-01-11）