纖溶酶注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

費(fèi)麗娜 呂剛 李立冬

（1吉林省吉林市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林132011；2吉林省吉林市職業(yè)病防治院，吉林132011）

纖溶酶注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

費(fèi)麗娜1呂剛2李立冬1

（1吉林省吉林市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林132011；2吉林省吉林市職業(yè)病防治院，吉林132011）

目的通過(guò)對(duì)纖溶酶注射液細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法試驗(yàn)，建立纖溶酶注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。方法采用《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄中檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的凝膠法，即采用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品與鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，判斷纖溶酶注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量。結(jié)果鱟試劑靈敏度在0.5EU/ml時(shí)，纖溶酶注射液稀釋到濃度為0.4單位（U）/ml時(shí)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)論使用細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè)纖溶酶注射液中的污染內(nèi)毒素是可行的，可以用細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠檢查法代替家兔熱原檢查法。

細(xì)菌內(nèi)毒素；鱟試劑；纖溶酶注射液

纖溶酶注射液為無(wú)色或淡黃色澄明水溶液，本品為從長(zhǎng)白山白眉蝮蛇蛇毒中提取的蛋白水解酶。臨床用于治療腦梗死、高凝血狀態(tài)及血栓性脈管炎等外周血管疾病。目前該品種中的內(nèi)毒素檢查為家兔熱原試驗(yàn)法，不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、干擾因素多，而且結(jié)果的重現(xiàn)性差。采用檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的凝膠法，則可避免以上缺陷，直接檢測(cè)出供試品中污染的內(nèi)毒素。本實(shí)驗(yàn)報(bào)道用凝膠法檢測(cè)纖溶酶注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素的可行性研究。

1 材料與方法

1.1 材料細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（180EU/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批號(hào)150601-200965），鱟試劑靈敏度0.5 EU/ml（湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn)批號(hào)：051020），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：050960）。纖溶酶注射液1ml：100單位（U）/支（多菲制藥中國(guó)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20100601、20100806、20100902）。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)核鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λb）將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，并在快速混勻器上充分混合15min，將工作標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成2、1、0.5、0.25λb等系列濃度，每一濃度稀釋液平行做4管，結(jié)果符合規(guī)定，按下式計(jì)算鱟試劑靈敏度測(cè)定值（λc）：

1.2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定參照纖溶酶注射液說(shuō)明書(shū)按公式:L=K/M，式中K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射液的K=5EU/（kg?h），每小時(shí)人體可以接受的最大內(nèi)毒素劑量為（5Eu/kg·hr）×60=300Eu/hr（人平均體重按60kg計(jì)算），而纖溶酶注射液人用每次最大劑量為300單位，溶于500ml葡萄糖注射液或氯化鈉注射液中，葡萄糖注射液或氯化鈉注射液的內(nèi)毒素限值為0.5Eu/ml，按每小時(shí)250ml輸入人體計(jì)算，則葡萄糖注射液或氯化鈉注射液帶入的內(nèi)毒素最大量為125Eu/hr，故纖溶酶注射液允許帶入的內(nèi)毒素最大量為300－125=175Eu/hr。因?yàn)槔w溶酶注射液每小時(shí)注入人體量為150單位，所以纖溶酶注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值為175/150=1.17Eu/U，為方便稀釋，將其限值（L）定為1.15Eu/U。

1.2.3 供試品的最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)計(jì)算以鱟試劑靈敏度λb=0.5EU/ml為基準(zhǔn)，根據(jù)公式MVD=cL/λb =300×1.15/500×0.5=1.4倍。即供試品濃度稀釋為0.4U/ml時(shí)，可進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.4 干擾實(shí)驗(yàn)取3個(gè)批號(hào)的纖溶酶注射液，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋成1.2U/ml、1.0U/ml、0.6U/ml、0.4U/ml系列濃度，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2、1、0.5、0.25λb系列濃度與鱟試劑進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明，只有在供試品濃度稀釋為0.4U/ml時(shí)，鱟試劑靈敏度為0.5EU/ml時(shí)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，Es、Et都在0.5λ～2 λ范圍內(nèi)。見(jiàn)表1。

表13 批纖溶酶注射液干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2 結(jié)果

根據(jù)上述試驗(yàn)條件測(cè)定數(shù)據(jù)，從3批供試品中隨機(jī)各抽取2支，按批次分為3組，將供試品稀釋成濃度為0.4U/ml的溶液。每組取4支0.1ml鱟試劑，分別加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，再分別加入上述稀釋好的供試品溶液各0.1ml。其中2支為供試品平行管；另2支加入細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品0.1ml為供試品陽(yáng)性管；陰性對(duì)照管加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1ml；陽(yáng)性對(duì)照管加細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品0.1ml。將各管中溶液輕輕混勻后塞嚴(yán)，垂直放入（37±1）℃恒溫水浴鍋保溫60min。將試管從水浴中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180度觀察管內(nèi)凝膠，不變形不從管壁滑落為陽(yáng)性（+），反之為陰性（－），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 纖溶酶注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果

3 討論

由于纖溶酶注射液有一定的刺激性，在進(jìn)行熱原實(shí)驗(yàn)時(shí)常引起家兔的躁動(dòng)，容易對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。故本研究的目的就是參照藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代熱原檢查法的可行性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并建立纖溶酶注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，為該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)正提供數(shù)據(jù)支持。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。自20世紀(jì)60年代鱟血凝集機(jī)制的發(fā)現(xiàn)和鱟實(shí)驗(yàn)方法的建立，引起了各國(guó)藥政管理部門的極大興趣，并使細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在藥品的熱原限量控制中得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。特別是《中國(guó)藥典》2005年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法正式收載，使細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在我國(guó)得到肯定、應(yīng)用和推廣，它還將有力地推動(dòng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法在我國(guó)的新進(jìn)展[1]。由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法敏感性太高，除要求在潔凈條件下試驗(yàn)外，供試品中可能存在的對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法有干擾的物質(zhì)都可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響，經(jīng)過(guò)多次稀釋抗干擾試驗(yàn)、調(diào)整鱟試劑的靈敏度，試驗(yàn)結(jié)果顯示供試品稀釋成濃度為0.4U/ml時(shí)，鱟試劑靈敏0.5EU/ml可消除其干擾[2]。用此法檢查纖溶酶注射液中污染的內(nèi)毒素具有靈敏、快速、方便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010.

[2]中國(guó)藥品生物制品檢定所.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范和藥品檢驗(yàn)儀器操作規(guī)程[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

首屆中醫(yī)藥養(yǎng)生長(zhǎng)壽文化學(xué)術(shù)交流會(huì)

暨中醫(yī)藥走進(jìn)長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)——巴馬即將召開(kāi)

由中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)主辦，《世界中西醫(yī)結(jié)合雜志》承辦的首屆中醫(yī)藥養(yǎng)生長(zhǎng)壽文化學(xué)術(shù)交流會(huì)，擬于2012年10月在廣西巴馬召開(kāi)，現(xiàn)將有關(guān)事宜通知如下：

1征文內(nèi)容：古代醫(yī)家的養(yǎng)生理念、術(shù)數(shù)及飲食起居等；古代文人的中醫(yī)藥養(yǎng)生軼文故事；現(xiàn)代長(zhǎng)壽老人的養(yǎng)生秘訣；長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)的地理、人文、飲食等長(zhǎng)壽因素探索；中醫(yī)藥養(yǎng)生優(yōu)勢(shì)探討；中醫(yī)藥養(yǎng)生前瞻性研究；與養(yǎng)生長(zhǎng)壽有關(guān)的其他內(nèi)容。

2征文要求：稿件請(qǐng)注明作者姓名、單位、地址、郵編、電話、E-mail、字?jǐn)?shù)不超過(guò)4000字；以word文檔形式發(fā)送至E-mail:yscszhengwen@126.com；截稿日期：2012年9月1日。

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10.3969/j.issn.1672-2779.2012.05.110

1672-2779（2012）-05-0157-02

：蘇玲

2012-02-07）