烏鱧魚卵中胰蛋白酶抑制劑的分離純化及性質(zhì)研究

歐 雪 ，袁卉華，劉錚兆，吳守亮，顧婷婷，韓曜平

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 2 15500）

蛋白酶抑制劑是一類能抑制蛋白水解酶催化活性的蛋白或多肽[1].蛋白酶抑制劑具有防止生物體內(nèi)不必要的蛋白降解的作用，能調(diào)節(jié)各種蛋白酶的催化活性[2-3].作為自然界中含量最為豐富的蛋白種類之一，蛋白酶抑制劑廣泛分布于植物、動物和微生物的組織中[4-6].

研究發(fā)現(xiàn)，魚類組織中存在多種具有生物活性的蛋白及多肽.近年來，有學(xué)者報道了來源于幾種魚血清[7-8]、肌肉[9-11]和卵中的胰蛋白酶抑制劑[12-14].然而，迄今為止，有關(guān)魚卵中胰蛋白酶抑制劑的純化研究還比較少.特別是對于淡水魚卵中蛋白酶抑制劑的研究在國內(nèi)尚屬空白.本研究以烏鱧魚卵為研究材料，利用凝膠層析和發(fā)色底物檢測等技術(shù)手段從烏鱧魚卵中分離純化得到了一種胰蛋白酶抑制劑，并進(jìn)一步研究其部分理化性質(zhì)，為淡水魚卵的高效利用提供理論依據(jù).

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用魚為烏鱧（Ophicephalus argus），均采購于江蘇省常熟市農(nóng)貿(mào)市場，共5條，體重為500～1000 g，體長300～500 mm，全部為性成熟雌體.

胰蛋白酶（Trypsin），發(fā)色底物N-Benzoyl-L-Arg-4-nitroanilide hydrochloride（B-3133），購自Sigma公司；Sephadex G-50凝膠，Sephadex G-75凝膠，購自美國GE（Pharmacia）公司.其他國產(chǎn)試劑為分析純，符合要求.

試驗(yàn)用主要儀器有冷凍離心機(jī)、成套層析設(shè)備、蛋白電泳儀、紫外/可見分光光度計(jì)等.

1.2 分離純化[15]

1.2.1 卵勻漿液的制備

活體烏鱧魚用水清洗干凈，魚體剖腹取卵，用清水沖洗干凈血污，加適量純水后，研磨勻漿，4℃，10000 rpm，離心30 min，收集上清液，制成凍干粉備用.

1.2.2 Sephadex G-50凝膠過濾層析

用0.1 M磷酸氫鹽緩沖溶液（PBS，pH6.0）平衡凝膠過濾柱（2.6×100 cm）；將凍干粉溶解于適量的0.1 M磷酸氫鹽緩沖溶液（pH6.0）中，12000 rpm，20 min離心，取上清液用0.45 um濾膜過濾后上樣于平衡好的Sephadex G-50凝膠過濾柱（100 cm×2.6 cm），用平衡用緩沖溶液進(jìn)行洗脫，流速3 mL/10 min，收集洗脫液，280 nm紫外分光光度計(jì)檢測各收集管蛋白或多肽含量，收集活性峰，凍干備用.

1.2.3 Sephadex G-75凝膠過濾層析

用0.1 M磷酸氫鹽緩沖溶液（PBS，pH6.0）平衡凝膠過濾柱（2.6×100 cm）；將Sephadex G-50凝膠過濾層析得到的活性峰凍干粉溶于0.1 M磷酸氫鹽緩沖溶液（PBS，pH6.0）中，12000 rpm，20 min離心，取上清液用0.45 μm濾膜過濾后上樣于平衡好的Sephadex G-75凝膠柱，用平衡用緩沖溶液進(jìn)行洗脫，流速2.6 mL/10 min，收集洗脫液，280 nm紫外分光光度計(jì)檢測各收集管蛋白含量，合并各洗脫峰，凍干備用.

1.3 烏鱧魚卵蛋白酶抑制劑活性檢測及抑制常數(shù)確定[15]

蛋白酶抑制劑活性檢測參照文獻(xiàn)[15]，具體方法如下：在50 mM Tris-HCl緩沖溶液的反應(yīng)體系中，于25℃測定待測樣品對胰蛋白酶水解生色底物的抑制影響，將不同濃度的待測樣品與蛋白酶（終濃度為30 nM 胰蛋白酶）于25℃保溫15 min，加入終濃度為0.3 mM的發(fā)色底物（B-3133）起動反應(yīng).連續(xù)3 min于405 nm處監(jiān)測光吸收的變化.分離純化的每一步均采用胰蛋白酶與發(fā)色底物（B-3133）檢測抑制劑活性.1單位的酶活由每分鐘釋放的對硝基苯胺的量來表示，1單位的抑制作用指對每分鐘釋放1 nmol的對硝基苯胺胰蛋白酶活性的抑制.

烏鱧魚卵蛋白酶抑制劑對蛋白酶的抑制穩(wěn)定性測定方法如上.能夠被抑制的蛋白酶分別與反應(yīng)緩沖液、相應(yīng)濃度純化的卵蛋白酶抑制劑于25 ℃保溫，時間分別為0.5 h、1 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h.以無抑制劑時的酶活力為100%，計(jì)算剩余酶活力.

按照Dixon的方法[16]測定純化的烏鱧魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑對蛋白酶的抑制常數(shù)（Ki）[7].簡單過程為：不同量純化的烏鱧魚卵蛋白酶抑制劑溶解于50 mM Tris-HCl緩沖溶液中，分別與一定量的胰蛋白酶（最終濃度為68 nM）于室溫下保溫15分鐘，最后加入酶相對應(yīng)的發(fā)色底物啟動反應(yīng)，于405 nm處監(jiān)測 5 min內(nèi)吸收值的變化，空白對照加同抑制劑體積的50 mM Tris-HCl緩沖溶液.抑制常數(shù)按公式Ki=[I]/（V0/V1+1）計(jì)算，其中[I]為烏鱧魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑的摩爾濃度，V0為空白對照（無抑制劑）反應(yīng)的反應(yīng)速度，V1為加抑制劑時的反應(yīng)速度.實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取平均值.

1.4 SDS-PAGE電泳及分子量的測定

分離純化過程各組分的純度用SDS-PAGE電泳檢測.SDS-PAGE參考汪家政的方法[16]，采用不連續(xù)高pH電泳膠，分離膠濃度為12%，pH8.8；堆積膠濃度為3.9%，pH6.8.SDS-PAGE中，純化的樣品在上樣緩沖液（非還原狀態(tài)）中，100℃處理5 min.凝膠于含0.1%考馬斯亮蘭R-250的甲醇/乙酸/水（3/1/6）中染色.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白為上海生化所的分子量蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn).純化樣品分子量用SDS-PAGE電泳測定.

1.5 烏鱧魚卵的蛋白酶抑制劑的熱及酸堿穩(wěn)定性[15]

1.5.1 熱穩(wěn)定性

純化的烏鱧魚卵蛋白酶抑制劑樣品溶液（終濃度45 nM）在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃加熱10 min，取出后立即冷卻，然后按前面1.3檢測抑制劑活性的方法測定處理樣品的抑制活性.

1.5.2 酸堿穩(wěn)定性

純化的烏鱧魚卵蛋白酶抑制劑樣品溶液（終濃度45 nM）與等體積的pH2～11的各種緩沖溶液混合，4℃放置18小時，然后用0.4 MTris-HCl緩沖溶液，pH7.8調(diào)整抑制劑混合溶液的pH值為7.8并測定其抑制劑活性.

1.6 蛋白濃度測定

蛋白濃度測定采用BCA（Bicinchoninic Acid，二喹啉甲酸）法（試劑盒，購自上海鼎國生物公司）測定樣品蛋白含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

2 結(jié)果與分析

2.1 烏鱧魚卵蛋白酶抑制劑分離純化

烏鱧魚卵勻漿液經(jīng)Sephadex G-50凝膠過濾曲線圖譜見圖1.烏鱧魚卵勻漿液經(jīng)此步分離得到2個峰，以B-3133為底物經(jīng)tryspin抑制活性測定發(fā)現(xiàn)，活性峰為第I峰（箭頭所指）.收集合并活性峰，凍干備用.

合并Sephadex G-50凝膠過濾的第Ⅰ峰凍干后經(jīng)Sephadex G-75凝膠過濾層析，所得圖譜見圖2.經(jīng)胰蛋白酶抑制活性測定發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ峰（箭頭所指）胰蛋白酶抑制活性最高，收集該峰備用.

圖1 烏鱧魚卵過Sephadex G-50凝膠過濾洗脫曲線

圖2 Sephadex G-50凝膠過濾層析所得第Ⅰ峰過Sephadex G-75凝膠過濾洗脫曲線

2.2 SDS-PAGE蛋白電泳

在SDS-PAGE還原與非還原條件下，純化的蛋白酶抑制劑（lane2，lane3）表現(xiàn)出單一條帶，表明該蛋白不含二硫鍵.其表觀分子量分別約為42 kDa，而未通過Sephadex G-50的樣品（lane4，lane5）條帶較多（見圖3）.表明達(dá)到了很好的分離效果.

2.3 烏鱧魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑活性檢測及抑制常數(shù)的確定

從圖4可以看出，純化的烏鱧魚卵提取液的絲氨酸蛋白酶抑制劑能抑制胰蛋白酶水解底物的活性.當(dāng)烏鱧魚卵提取的抑制劑蛋白濃度約為130 μg/mL（箭頭所指）以上時，可以抑制95%以上的68 nM濃度的胰蛋白酶的水解活性.

通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按抑制常數(shù)（Ki）公式計(jì)算[15]，純化的烏鱧魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制常數(shù)為30.3 nM.

圖3 分離純化烏鱧卵絲氨酸蛋白酶抑制劑及未純化樣品的SDS-PAGE電泳分析

2.4 烏鱧魚卵的絲氨酸蛋白酶抑制劑的熱及酸堿穩(wěn)定性

烏鱧魚卵提取物的絲氨酸蛋白酶抑制劑熱的穩(wěn)定性檢測見圖5，從檢測的數(shù)據(jù)看，在30～100℃溫度處理的條件下，純化的烏鱧魚卵的絲氨酸蛋白酶抑制劑能抑制胰蛋白酶對發(fā)色底物（B-3133）的水解活性，即使溫度高達(dá)100℃，仍能保持75%以上的抑制劑活性.

對酸堿的穩(wěn)定性檢測見圖6.在pH2～11處理?xiàng)l件下，純化的烏鱧魚卵的絲氨酸蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶水解發(fā)色底物（B-3133）的抑制活性幾乎達(dá)到了90%以上.只有在pH值為12時酶活性才降低到50%.說明這種絲氨酸蛋白酶抑制劑具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性.本研究為該種絲氨酸蛋白酶的利用提供了有價值的信息，也為大規(guī)模分離純化該種抑制劑提供了新思路，即可以通過加熱及酸堿處理，先期除去部分不耐熱和酸堿的蛋白質(zhì)，使分離純化效率更高.

圖4 魚卵提取物對蛋白酶抑制活性檢測

圖5 溫度對烏鱧魚卵蛋白酶抑制活性的影響

圖6 pH對烏鱧魚卵蛋白酶抑制活性的影響

3 討論

本研究通過凝膠色譜技術(shù)，從烏鱧魚卵的勻漿液中得到了表觀分子量大約為42 kDa的絲氨酸蛋白酶抑制劑，該抑制劑對胰蛋白酶有專一性的抑制作用.對該抑制劑進(jìn)行的穩(wěn)定性研究表明，該蛋白酶抑制劑在pH2～11時有比較好的pH穩(wěn)定性和溫度在30～100℃有較好的熱穩(wěn)定性.

目前，有關(guān)魚卵中蛋白酶抑制劑的研究已有一些報道[12-14].這些已純化和鑒定的抑制劑基本屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑.對其理化性質(zhì)尤其是熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性的研究將有助于推動該類抑制劑的利用.已有研究結(jié)果表明[12-14，17-18]，半胱氨酸蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性在50℃以下；酸堿穩(wěn)定性一般在pH3～10范圍內(nèi).因此，熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性高的蛋白酶抑制劑在一些高溫及極度偏酸堿的條件下，如食品加工、臨床用藥等應(yīng)用蛋白酶抑制劑，可避免因環(huán)境條件嚴(yán)酷帶來的活性喪失.本研究所分離的蛋白酶抑制劑在pH2～11時有較好的pH穩(wěn)定性和溫度在30～100℃有較好的熱穩(wěn)定性.因此，該抑制劑具有很高的實(shí)用價值.

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