Notch1活化對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226增殖及藥物敏感性的影響

郭冬梅，李玉娟，李純璞，白觀(guān)臣，陳 晨，滕清良

(泰安市中心醫(yī)院，山東泰安271000)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一種發(fā)生于B淋巴細(xì)胞的惡性漿細(xì)胞病，好發(fā)于中老年人，發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前主要采用化療、放療、免疫及造血干細(xì)胞移植治療。近年來(lái)，新型藥物的應(yīng)用使MM患者生存期有所延長(zhǎng)，但仍有較多患者發(fā)生耐藥及復(fù)發(fā)［1，2］。新近研究表明，Notch1 信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及預(yù)后中具有重要作用。2010年1月～2011年10月，我們利用攜帶Notch1-ICN的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染MM細(xì)胞株RP MI8226，觀(guān)察外源性Notch1信號(hào)對(duì)對(duì)MM細(xì)胞株RPMI8226增殖、周期改變及藥物敏感性的影響，旨在探索Notch1通路在MM發(fā)生、發(fā)展及耐藥中的作用，尋找MM治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人 MM 細(xì)胞株 RPMI8226，Notch1-ICN病毒(由目的基因質(zhì)粒 pMSCV-ICN/GFP、包裝質(zhì)粒pKat和編碼水泡性口膜炎病毒G-糖蛋白的包膜質(zhì)粒pCMV-VSV-G包裝而成)及對(duì)照病毒(CON)由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院惠贈(zèng);CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖的試劑盒(上海凱基生物技術(shù)有限公司)，兔抗人Notch1單克隆抗體(Abcam公司)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI，美國(guó) BD 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、處理及鑒定 ①細(xì)胞培養(yǎng)、處理:取人MM細(xì)胞株RPMI8226置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。首日按照每孔2×105/mL鋪24孔板，同時(shí)加入0.5 mL病毒上清及Polybrene(8μg/mL)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液過(guò)夜;第2、3天，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗1次，重復(fù)第1天步驟。采用限制性稀釋方法獲得單個(gè)細(xì)胞，篩選穩(wěn)定感染細(xì)胞。獲取RPMI8226-ICN及RPMI8226-CON細(xì)胞(分別為病毒組及病毒對(duì)照組)，同時(shí)設(shè)未經(jīng)感染的細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染組。②鑒定:選取上述三組細(xì)胞，裂解后收集蛋白樣品，采用Western blot法檢測(cè)Notch1-ICN蛋白表達(dá)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 細(xì)胞增殖情況檢測(cè) 按每孔5×103個(gè)細(xì)胞將上述三組細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置CO2孵箱培養(yǎng)4 d，其后按照CCK-8試劑盒說(shuō)明操作，每孔加入10 μL的 CCK-8液，分別于24、48、72、96 h后在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度值(A值)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 藥物敏感性檢測(cè) 選取1.2.1中三組細(xì)胞，按1×103/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，分別將濃度為 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L 的硼替佐米加入培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)48 h后按照CCK-8試劑盒說(shuō)明操作，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度值(A值)。根據(jù)公式(1－用藥組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%計(jì)算細(xì)胞抑制率。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、A值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 選取1.2.1中三組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，用PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL;1 000 r/min離心10 min;用75%冰乙醇懸浮，4℃過(guò)夜固定;次日PBS洗滌，1 000 r/min離心10 min，去除乙醇;分別加入500 L含有RNaseA的PI溶液，4℃避光30 min;用流式細(xì)胞儀測(cè)定單個(gè)細(xì)胞核中PI-DNA含量，用摻入的PI熒光強(qiáng)度反映單個(gè)細(xì)胞核中DNA含量，測(cè)定細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定 病毒組細(xì)胞Notch1-ICN蛋白表達(dá)水平約為病毒對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組的2.5倍，見(jiàn)圖1。

圖1 三組RPMI8226細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)

2.2 細(xì)胞增殖情況和對(duì)硼替佐米藥物的敏感性培養(yǎng)后48、72、96 h病毒組細(xì)胞增殖率均顯著高于病毒對(duì)照組(P均＜0.01)，見(jiàn)圖2;隨硼替佐米濃度增高，各組細(xì)胞抑制作用均逐漸增加，且同濃度條件下病毒組抑制率顯著低于病毒對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組，見(jiàn)表1。

圖2 病毒組和病毒對(duì)照組細(xì)胞增殖曲線(xiàn)

表1 不同濃度硼替佐米作用下三組細(xì)胞增殖抑制率(n=3，%，ˉx ±s)

2.3 細(xì)胞周期 病毒組S期細(xì)胞比例明顯高于其余兩組(P 均 ＜0.01)，見(jiàn)圖3。

3 討論

圖3 三組細(xì)胞周期比例

研究顯示，造血系統(tǒng)的多種惡性疾病如白血病、淋巴瘤和MM中均存在Notch活化。Notch信號(hào)異常與多種腫瘤的發(fā)病、細(xì)胞周期阻滯和治療預(yù)后有關(guān)。新近研究顯示，Notch信號(hào)在不同腫瘤組織及腫瘤發(fā)展的不同階段均可發(fā)揮促癌或抑癌作用。Xu等［3］研究顯示，激活Notch信號(hào)可加快MM病情進(jìn)展。Nefedova等的細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Notchl-ICN可上調(diào)S期RPMI8226細(xì)胞比例，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。賈向旭等［5］發(fā)現(xiàn)，病毒感染細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)Notch1-ICN表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。Nefedova等［6］研究顯示，阻斷Notch1通路可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡增加，并可增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

為研究Notch信號(hào)通路在MM發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄病毒體系轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其特點(diǎn)為高效地將目的基因整合到染色體上穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)果顯示，應(yīng)用Notch1-ICN感染MM細(xì)胞后病毒組Notch1-ICN表達(dá)明顯上調(diào)，約為病毒對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組的2.5倍;培養(yǎng)后48、72、96 h病毒組細(xì)胞增殖率均顯著高于病毒對(duì)照組。提示上調(diào)Notchl表達(dá)可促進(jìn)RPMI8226細(xì)胞增殖。以硼替佐米為代表的新型靶向藥物的出現(xiàn)使MM患者的緩解率和總生存率顯著改善，但大部分患者仍然出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥。為研究Notch1表達(dá)上調(diào)對(duì)藥物敏感性的影響，本研究選擇硼替佐米用于實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示隨硼替佐米濃度增高，各組細(xì)胞抑制作用均逐漸增加，且同濃度條件下病毒組抑制率顯著低于病毒對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組。說(shuō)明Notch1通路活化可使RPMI8226細(xì)胞對(duì)硼替佐米敏感性降低。此外，本研究還顯示病毒組S期細(xì)胞比例明顯高于其余兩組。提示外源性Notchl活化可通過(guò)增加S期細(xì)胞比例促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，還可降低MM細(xì)胞對(duì)硼替佐米的敏感性。

綜上所述，Notch1信號(hào)通路活化與MM的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān)，有望成為MM治療的新靶點(diǎn)。

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