津黑兩地大白菜褐腐病病原菌鑒定及生物學(xué)特性的比較

苗國輝， 聞鳳英， 張耀偉＊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科潤蔬菜研究所，天津 300384）

大白菜［Brassica campestris L.ssp.pekinensis（Lour.）Olsson]是我國廣泛種植的蔬菜。褐腐病是大白菜生產(chǎn)中近幾年逐漸發(fā)展起來的病害，在武漢、天津、哈爾濱等地呈現(xiàn)出蔓延的趨勢，并被誤認(rèn)為細(xì)菌性軟腐病。大白菜褐腐病主要危害大白菜的葉柄，導(dǎo)致葉柄腐爛，使大白菜品質(zhì)降低，產(chǎn)量下降，其區(qū)別于細(xì)菌性軟腐病的特征是腐爛斑為褐色，無臭味。大白菜褐腐病致病菌為Rhizoctonia solani Kühn［1]。劉志恒［2]等對遼寧地區(qū)白菜葉腐病進(jìn)行鑒定，確定白菜葉腐病的病原菌是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）。何蘇琴等［3]通過對辣椒莖腐和根腐病的病組織進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)辣椒莖腐和根腐病的致病菌是立枯絲核菌。立枯絲核菌是一類廣泛存在于自然界中、并能引起多種作物病害的土壤習(xí)居真菌，到目前為止，立枯絲核菌共劃分為14個(gè)融合群、21個(gè)融合亞群［4]，Yang G H 等［5]確定甘藍(lán)葉腐病的病原菌是立枯絲核菌AG－4融合群；段春芳［6]等對云南地區(qū)的白菜、薄荷、萵苣葉腐病進(jìn)行鑒定，確定引起白菜、薄荷、萵苣葉腐病的病原菌是立枯絲核菌的AG－1IB亞群。Kuramae等［7]從巴西萵苣上分離的立枯絲核菌被鑒定屬于AG1－IA亞群；從花莖甘藍(lán)、菠菜、甜瓜、番茄4種作物上分離的立枯絲核菌被鑒定屬于AG－4融合群。肖勇等［8]通過對四川省水稻立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）進(jìn)行鑒定，分離得到55株立枯絲核菌，確定除D42菌株外，其余均屬于AG－1IA群；郭慶元等［9]研究發(fā)現(xiàn)立枯絲核菌的 AG－1、AG－2、AG－4也可危害豆類作物。

本試驗(yàn)通過對天津、黑龍江兩省市大白菜褐腐病進(jìn)行田間癥狀觀察、病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定及分子鑒定，確定兩地大白菜褐腐病的病原菌，并對兩地區(qū)的病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性的比較分析。

1 材料與方法

1.1 田間癥狀調(diào)查與取樣

對天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院科潤蔬菜試驗(yàn)站和哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地的大白菜褐腐病癥狀進(jìn)行田間觀察，并取樣。

1.2 病原菌鑒定

1.2.1 病原菌的分離和純化

將上述采集的病組織用水瓊脂法分離［10]，病原菌經(jīng)分離純化后保存于PDA斜面培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將供試菌株接種于PDA平板上，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)3d后，對其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察。12d后觀察是否產(chǎn)生菌核。菌絲形態(tài)觀察采用鄧振山［11]、許志剛的方法［12]。

1.2.3 病原菌致病性測定

采用苗期離體葉片法對分離的菌株進(jìn)行致病性測定。在接種時(shí)取完整的幼嫩葉片，洗凈后置于鋪有無菌吸水紙的鐵盤中，并在鐵盤中加入少許無菌水以保持濕度。將菌株在PDA上進(jìn)行擴(kuò)繁，在25℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)3d，用直徑為6mm的打孔器在活化好的菌落邊緣打取菌絲塊，用無菌接種針將菌絲塊接種于葉柄上，每個(gè)菌株接種20個(gè)葉片，以瓊脂塊接種的葉片作為對照。

1.2.4 病原菌分子鑒定

病原菌DNA提取采用Sun的方法［13]。用真菌的ITS序列通用引物ITS1和ITS4［14]對病原菌的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，反應(yīng)液組分為：10×Buffer（含 mg2＋）5μL，10mmol／L dNTP 4μL，5U／μLTap酶0.5μL，模板DNA1.0μL，用ddH2O使總體積達(dá)到50μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性1min；55℃退火1min，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，克隆至pEASY－T3克隆載體上，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中（兩者均由全式金公司提供），在含IPTG、X－gal、氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑法篩選，PCR檢測后送北京華大生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行BLAST比對分析，并從GenBank中下載23個(gè)菌株的相關(guān)ITS序列，用DNAStar軟件Meglign程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 病原菌融合群鑒定

融合群鑒定標(biāo)準(zhǔn)菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周而勛教授提供，采用陳延熙等改進(jìn)的玻片配對法［15]，將已分離鑒定出的立枯絲核菌TJ、DB兩菌株分別與AG1～AG8及AG－BI標(biāo)準(zhǔn)測試菌株配對培養(yǎng)進(jìn)行融合群鑒定。

1.3 津黑兩地病原菌生物學(xué)特性比較

1.3.1 不同碳源對菌絲生長、菌核形成的影響

基本培養(yǎng)基為查氏培養(yǎng)基［16]，以其蔗糖含碳量42.07%為標(biāo)準(zhǔn)，碳源用等質(zhì)量含碳量的葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉代替。供試菌株在PDA平板上25℃恒溫黑暗培養(yǎng)3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊接種到不同碳源的查氏培養(yǎng)基上，25℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)。3d后測其菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復(fù)。

1.3.2 不同氮源對菌絲生長、菌核形成的影響

基本培養(yǎng)基為查氏培養(yǎng)基［16]，以其硝酸鈉含氮量16.47%為標(biāo)準(zhǔn)，氮源用等質(zhì)量含氮量的硝酸鉀、蛋白胨、硝酸銨、甘氨酸、硫酸銨5種氮源代替。供試菌株在PDA平板上25℃恒溫黑暗培養(yǎng)3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊，接種到含不同氮源的查氏培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)。3d后測其菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復(fù)。

1.3.3 不同溫度對菌絲生長、菌核形成的影響

供試菌株在PDA平板培養(yǎng)基上25℃恒溫黑暗培養(yǎng)3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊移植到PSA培養(yǎng)基平板中央，置于21、23、25、27、29℃不同溫度下恒溫黑暗培養(yǎng)。3d后測定菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復(fù)。

1.3.4 不同pH對菌絲生長、菌核形成的影響

供試菌株在PDA平板培養(yǎng)基上25℃恒溫黑暗培養(yǎng)3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊移植到pH 分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的PSA培養(yǎng)基平板中央。于25℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)。3d后測定菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復(fù)。

1.3.5 不同光照條件對菌絲生長、菌核形成的影響

供試菌株在PDA平板培養(yǎng)基上25℃恒溫黑暗培養(yǎng)3d，在無菌條件下沿菌落邊緣打取直徑6mm的菌絲塊移植于PSA培養(yǎng)基平板中央，于25℃恒溫培養(yǎng)。光照分別為24h光照、12h光照、全黑暗。3d后測定菌落直徑，12d后測定氣生菌核干重。3次重復(fù)。

1.3.6 菌絲、菌核致死溫度測定

菌絲致死溫度測定：用水浴鍋設(shè)定40、42、44、46、48、50℃，將裝有無菌水的試管在水浴鍋里升至與水浴鍋的水相同溫度。供試菌株在PDA平板培養(yǎng)基上25℃恒溫黑暗培養(yǎng)3d，在無菌條件下從邊緣打取直徑6mm的菌絲塊移植于裝有無菌水的試管里，在不同溫度下處理10min后，移植于PSA平板上，3d后觀察其菌絲生長狀況。3次重復(fù)。

菌核致死溫度測定：供試菌株在PDA平板培養(yǎng)基上25℃恒溫黑暗培養(yǎng)12d后選取大小一致的菌核，將菌核移植于裝有無菌水的試管里，在不同溫度下處理10min后，在無菌環(huán)境下將菌核移植于PSA平板上，5d后觀察菌核萌發(fā)狀況。3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜褐腐病癥狀

大白菜褐腐病主要危害大白菜葉柄；病害初期從葉柄基部發(fā)病，病斑大小為1～4cm，病斑淺黃色且中間著生小黑點(diǎn)，以后逐漸擴(kuò)大凹陷成褐色至深褐色大斑，有時(shí)病斑表面呈現(xiàn)隱約的輪紋，濕度大時(shí)病斑上密生灰白色菌絲，逐漸聚集成團(tuán)，并形成褐色菌核；后期葉柄腐爛（圖1a、b）。

圖1 大白菜褐腐病癥狀

2.2 大白菜褐腐病病原菌分離

2.2.1 病原菌形態(tài)特征

菌絲初期白色，絨毛狀，有隔，近分支處有縊縮，分支初期成直角，后漸近銳角（圖2a）。生長后期，天津地區(qū)分離的TJ菌株的菌絲由白色變?yōu)楹稚酥辽詈稚▓D2b），黑龍江地區(qū)分離的DB菌株的菌絲由白色變?yōu)榈稚▓D2c），并在生長后期均形成菌核（圖2d）。

圖2 立枯絲核菌菌絲及菌落形態(tài)特征

2.2.2 致病性測定結(jié)果

將分離到的病菌菌絲塊接種到大白菜葉柄上，結(jié)果表明，葉柄接種2d后，出現(xiàn)黑褐色腐爛病斑，接種5d（圖1c、d）后，病斑擴(kuò)大至整個(gè)葉柄，且葉柄腐爛。接種發(fā)病率為100%，且癥狀與田間發(fā)病癥狀相同。對照葉片未發(fā)病。對發(fā)病葉片進(jìn)行再分離，可分離到與接種菌株形態(tài)一致的病原菌。說明該菌為致病菌株。

2.2.3 大白菜褐腐病分離菌株的分子鑒定

用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增了兩個(gè)菌株的核糖體基因ITS序列，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果顯示，分離菌株的核糖體基因ITS序列全長為650bp左右，這與預(yù)期片段長度一致。經(jīng)北京華大基因公司對PCR產(chǎn)物測序，確定兩菌株的ITS序列全長均為663bp。將兩菌株的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)的立枯絲核菌菌株的基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明TJ菌株ITS序列與Rhizoctonia solani isolate（JF817349.1、AY241 672.1、AY154 317.1，AB054 852.1、DQ279 002.1、EF532 828.1）相似性為100%，DB菌株序列與Rhizoctonia solani isolate（EU－591 761.1、DQ356 412.1、AF354 063.1、FJ435 141.1）相似性最高為99%。

將兩個(gè)菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中立枯絲核菌5.8S rDNA－ITS序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）可以看出，從大白菜褐腐病組織上分離的TJ菌株與Rhizoctonia solani isolate JF817 349列在同一組，表明它們之間差異不明顯，親緣關(guān)系近。而DB菌株獨(dú)立于其他立枯絲核菌菌株，表明DB菌株與其他已分離的立枯絲核菌菌株不同，為一株新的立枯絲核菌菌株，GenBank登錄號JN412 624。

圖3 基于5.8SrDNA－ITS核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.4 病原菌融合群鑒定

融合群鑒定表明，天津地區(qū)分離的TJ菌株與AG－2－1融合群融合，而與AG－1－IA等其他9個(gè)菌株不融合；黑龍江地區(qū)分離的DB菌株與AG－1融合，而與AG－2等其他9個(gè)菌株不融合（表1）。因此確定TJ菌株屬于AG－2融合群，DB菌株屬于AG－1融合群。

表1 TJ、DB兩菌株的融合群鑒定1）

2.3 津黑兩地菌株的生物學(xué)特性比較

2.3.1 不同碳源對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4a①可知，不同碳源對兩菌株菌絲生長具有明顯的影響。兩菌株利用碳源相同點(diǎn)均是在以淀粉為碳源的查氏培養(yǎng)基上生長最快，在果糖上生長最慢，且與其他碳源呈顯著差異；不同點(diǎn)是以可溶性淀粉、葡萄糖為碳源時(shí)，DB菌株生長速率較快，以果糖為碳源時(shí)，TJ菌株生長速率較快。

由圖4a②可知，兩菌株在不同碳源查氏培養(yǎng)基上生長時(shí)，其菌核形成有明顯的差異。相同點(diǎn)是兩菌株在以可溶性淀粉為碳源生長時(shí)最先形成氣生菌核，且兩菌株在以蔗糖為碳源時(shí)形成的氣生菌核量均是最多，且與其他碳源呈顯著性差異。葡萄糖和可溶性淀粉次之，以乳糖和果糖為碳源時(shí)形成的氣生菌核量最少。半埋式菌核形成量均是蔗糖最多，葡萄糖和可溶性淀粉次之。兩菌株菌核形成差異是，TJ菌株在以乳糖和果糖為碳源的查氏培養(yǎng)基上生長時(shí)均生成半埋式菌核；DB菌株在以乳糖和果糖為碳源的查氏培養(yǎng)基上生長時(shí)未見半埋式菌核。并且TJ菌株在不同碳源的查氏培養(yǎng)基上生長時(shí)菌核形成量均快于并且多于DB菌株。

圖4 TJ和DB菌株生物學(xué)特性比較

2.3.2 不同氮源對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4b①可知，不同氮源對兩菌株生長具有明顯影響。兩菌株利用氮源相同點(diǎn)是在以蛋白胨為氮源時(shí)生長最快，在以甘氨酸為氮源時(shí)生長最慢，且菌絲在兩氮源上的生長呈顯著性差異。兩菌株在氮源不同的查式培養(yǎng)基上生長時(shí)均是DB菌株生長速率快于TJ菌株。

由圖4b②可知，在不同氮源查式培養(yǎng)基上生長時(shí)，兩菌株菌核形成的相同點(diǎn)是，兩菌株均在以硝酸銨和硫酸銨為氮源時(shí)最先形成氣生菌核，氣生菌核量均是硫酸銨最多，且均以甘氨酸為氮源時(shí)形成氣生菌核量最少，并且兩氮源之間呈顯著性差異。兩菌株菌核形成差異是，TJ菌株在以硝酸鉀為氮源時(shí)最先形成半埋式菌核，且形成半埋式菌核量最多，與其他氮源呈顯著性差異；DB菌株在以硝酸銨為氮源時(shí)最先形成半埋式菌核，且形成半埋式菌核最多；在不同氮源上生長時(shí)TJ菌株與DB菌株相比菌核形成速度快且形成量大。

2.3.3 不同溫度對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4c①可知，兩菌株均在25℃時(shí)生長最快且菌絲層最厚，21～25℃菌絲生長差異不顯著，29℃時(shí)菌絲均生長最慢且菌絲層最薄，25℃和29℃條件下菌絲生長呈顯著性差異。并且在不同溫度下生長速度DB菌株普遍快于TJ菌株，DB菌株菌絲層厚度大于TJ菌株，氣生菌絲多于TJ菌株。

由圖4c②可知，在不同溫度下生長時(shí)，兩菌株形成菌核的相同點(diǎn)是，均在25℃時(shí)氣生菌核和半埋式菌核量最多。兩菌株不同點(diǎn)是，TJ菌株半埋式菌核量及氣生菌核量在29℃時(shí)均是最少，而DB菌株則是在21℃時(shí)半埋式菌核量最少，氣生菌核量則是29℃時(shí)最少；兩種菌株在不同溫度下生長時(shí)菌核形成速度及形成量均是TJ菌株快于并且大于DB菌株。

2.3.4 不同pH對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4d①可以看出，不同pH對兩菌株的菌絲生長影響也有明顯影響。兩菌株在pH7時(shí)生長均是最快且菌絲層最厚，pH9時(shí)均是生長最慢且菌絲層最薄且兩者之間呈顯著性差異，pH5～7菌絲生長差異不明顯。在不同pH條件下DB菌株的菌絲生長速度快于TJ菌株。

由圖4d②可知，兩種菌株均在pH7時(shí)氣生菌核和半埋式菌核量最多，pH5時(shí)氣生菌核量均是最少，且pH5和pH7的菌核量呈顯著性差異，不同的是TJ菌株的菌核量多于DB菌株，并先于DB菌株形成菌核。

2.3.5 不同光照對菌絲、菌核生長的影響比較

由圖4e①可知，兩菌株均是在12h光照時(shí)菌絲生長最快且菌絲層最厚，而在全黑暗時(shí)菌絲生長最慢且菌絲層最薄。并且在不同光照條件下菌株生長速度DB菌株普遍快于TJ菌株。

由圖4e②可知，兩種菌株均是在12h光照時(shí)氣生菌核和半埋式菌核量最多，全黑暗時(shí)氣生菌核和半埋式菌核量最少。不同的是TJ菌株的菌核量多于DB菌株，并先于DB菌株形成菌核。

2.3.6 致死溫度比較

由表2可知兩菌株相同點(diǎn)是在低于40℃下均能存活，而在42℃以上時(shí)菌絲均不能生長。兩菌株的不同點(diǎn)是菌核致死溫度TJ菌株為46℃，而DB菌株則為48℃。

表2 TJ、DB兩菌株菌絲、菌核致死溫度的比較

3 結(jié)論與討論

通過對天津和黑龍江兩個(gè)地區(qū)的大白菜褐腐病病原菌常規(guī)分離鑒定、分子鑒定，確定導(dǎo)致兩地區(qū)大白菜褐腐病的致病菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn），通過融合群鑒定及5.8SrDNA－ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析確定兩菌株分別屬于AG－2和AG－1兩個(gè)融合群，并且DB菌株為一個(gè)新菌株，GenBank登錄號JN412 624。

不同培養(yǎng)條件對菌絲生長影響的測定結(jié)果表明，TJ、DB兩菌株生長最適pH為7，與劉志恒等研究結(jié)果相似［1，18]；兩菌株均是在以可溶性淀粉和蛋白胨為碳源和氮源的培養(yǎng)基上生長時(shí)菌絲生長最快，這與林清等人研究結(jié)果相似［17]，而劉志恒等人從番茄莖基腐病分離的立枯絲核菌，最適氮源為硝酸鈉［18]。試驗(yàn)確定TJ、DB兩菌株的最適生長溫度為25℃，在12h光照時(shí)菌絲生長最快且菌絲層最厚，這與劉志恒結(jié)果不一致，其研究發(fā)現(xiàn)黑暗條件有利于白菜絲核菌葉腐病病原菌（Rhizoctonia solani Kühn）菌絲生長，而全光照與12h光暗交替條件下菌絲生長緩慢［2]；同時(shí)劉志恒認(rèn)為導(dǎo)致番茄莖基腐病的立枯絲核菌最適溫度為20℃［18]。在菌核形成方面，TJ、DB菌株均是在pH7時(shí)、以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長時(shí)最先形成氣生菌核，這與劉志恒等研究結(jié)果相似［2]。兩菌株在氮源、溫度對菌核形成影響上與劉志恒等結(jié)果有所差異［2，18]；兩菌株均在12h光照條件下氣生菌核和半埋式菌核形成量最多，全黑暗條件下最少，而劉志恒等認(rèn)為光照對白菜絲核菌葉腐病病原菌（Rhizoctonia solani Kühn）菌核形成量無關(guān)［2]。同時(shí)張麗等認(rèn)為甘藍(lán)立枯絲核菌球腐病病原菌在連續(xù)光照下有利于菌核形成［4]。據(jù)此認(rèn)為，寄主來源不同的立枯絲核菌由于其各自發(fā)生環(huán)境不同或是菌群分化等的影響，致使病原菌某些生物學(xué)特性存在一定差異。

本試驗(yàn)測定致死溫度時(shí)，先將試管溫度升至設(shè)定的溫度，確定兩菌株的菌絲致死溫度均為42℃，菌核致死溫度則分別為TJ菌株46℃，DB菌株48℃；而劉志恒等認(rèn)為從番茄莖基腐病分離的立枯絲核菌菌絲致死溫度為50℃，菌核致死溫度為59℃［18]；張麗等人認(rèn)為包菜立枯絲核菌球腐病病原菌菌絲致死溫度為45℃，菌核致死溫度為50℃［4]。這些差異還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

在不同碳源、氮源、溫度、pH下，DB菌株菌絲生長速度快于TJ菌株，但TJ菌株先于DB菌株形成菌核，并且菌核量多于DB菌株，說明兩個(gè)菌株在生長發(fā)育過程中存在明顯差異，形成了與兩地生態(tài)環(huán)境相適應(yīng)的無性繁殖過程。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在不同碳源、氮源、溫度、pH下，兩菌株菌核形成存在明顯差異，如TJ菌株在以硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上形成半埋式菌核量最多；DB菌株以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上形成半埋式菌核最多，這可能與兩菌株分屬于不同融合群、具有不同生態(tài)適應(yīng)性有關(guān)。

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