雙翅目昆蟲(chóng)線粒體基因組研究進(jìn)展

梅 琰，岳巧云，賈鳳龍*

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275;2.中山市出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東中山 528403)

雙翅目Diptera 是昆蟲(chóng)五大目之一。近年來(lái)，由于mtDNA 因母性遺傳(徐慶剛等，2001)、拷貝多、易用通用引物擴(kuò)增、相對(duì)核基因小等特點(diǎn)，越來(lái)越多地被運(yùn)用于雙翅目昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳變異、近緣種的識(shí)別(Schroeder et al.，2003)等研究。線粒體基因組研究方法的成熟，特別是長(zhǎng)片段PCR 擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用，使得雙翅目昆蟲(chóng)線粒體基因組的研究飛速發(fā)展。截止2011年12月，共有49種雙翅目線粒體基因組序列提交到了NCBI的GenBank 中，另外還有12種果蠅Drosophila和尖音庫(kù)蚊Culex pipiens pipiens 的線粒體DNA 序列除了A+T富含區(qū)外其他部分完成了測(cè)序提交到了NCBI 的GenBank 中。線粒體基因在雙翅目系統(tǒng)學(xué)研究中已被廣泛應(yīng)用，尤其在環(huán)裂亞目中(Wiegmann et al.，2003，2011;Kutty et al.，2008，2010)。關(guān)于應(yīng)用線粒體基因進(jìn)行雙翅目分子系統(tǒng)學(xué)、近緣物種的鑒定、COI 基因等方面的應(yīng)用國(guó)內(nèi)已經(jīng)有人做了綜述(葛振萍等，2007;池宇等，2010)，此文不再涉及。本文目的是將雙翅目線粒體基因組的研究進(jìn)展進(jìn)行如下介紹.

1 雙翅目昆蟲(chóng)mtDNA 基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

雙翅目昆蟲(chóng)mtDNA和其他的動(dòng)物的一樣也是一個(gè)雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀分子，大小在14～20 kb之間?；蚪M的大小主要是由A+T富含區(qū)(又稱控制區(qū))的長(zhǎng)短決定的(Boore et al.1999;Oliveira et al.，2007)。在已知雙翅目mtDNA 基因組中，癭蚊科Cecidomyiidae 的Rhopalomyia pomum的長(zhǎng)度為14503 bp，是已知雙翅目中基因組最小的，該物種的tRNA 基因發(fā)生了類似蜘蛛綱Arachnida中Habronattus oregonensis的缺失(Beckenbach et al.，2009)。最大的mtDNA 基因組是黑腹果蠅Drosophila melangaster，為19517 bp，A+T富含區(qū)長(zhǎng)達(dá)4601 bp(Lewis et al.，1994)。

雙翅目昆蟲(chóng)mtDNA 基因組相對(duì)保守，亞庫(kù)巴果蠅Drosophila yakuba 為其中的代表，mtDNA 基因組由37個(gè)基因組成，其中13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因是與氧化磷酸化相關(guān)的功能基因，分別是:NADH-Q 還原酶7個(gè)亞基(ND1-6 及ND4L)，細(xì)胞色素氧化酶3個(gè)亞基(COI-III)，ATP 合成酶的2個(gè)亞基(ATP6和ATP8)，細(xì)胞色素還原酶的1個(gè)亞基(Cytb)。22個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 編碼基因，其中有18個(gè)tRNA 基因分別對(duì)應(yīng)18種不同的氨基酸，但有兩種比較特殊，絲氨酸和亮氨酸t(yī)RNA 各有兩種，分別是tRNA-leu(CUN)、tRNA-leu(UUR)、tRNA-ser(AGN)、tRNA-ser(UCN)。另2個(gè)為線粒體核糖體RNA 基因(12S rRNA和16S rRNA)，此外還有一個(gè)影響mtDNA 基因組大小的A+T富含區(qū)，也是線粒體基因組中最大的非編碼區(qū)，長(zhǎng)度變化很大。據(jù)NCBI 中GenBank 的數(shù)據(jù)，雙翅目中家蠶追寄蠅Exorista sorbillans 的A+T富含區(qū)長(zhǎng)最短，僅104 bp，黑腹果蠅最長(zhǎng)，為4601 bp。除了這個(gè)最大的非編碼區(qū)外，線粒體基因組中在兩個(gè)相鄰的基因之間還存在著短的非編碼區(qū)，又稱基因間隔區(qū)。如在螺旋蠅Cochliomyia hominivorax 線粒體基因組中有14個(gè)基因間隔區(qū)，長(zhǎng)度在1～18 bp 不等，總長(zhǎng)120 bp(Lessinger et al.，2000)。

雙翅目昆蟲(chóng)線粒體基因組的兩條鏈都參與基因的編碼，以Drosophila yakuba 為典型的代表，如圖1 所示。其中J(majority)鏈中包含了9種蛋白質(zhì)編碼基因和14種tRNA 基因，9種蛋白質(zhì)編碼基因分 別 是COI-III，ND2，ND3，ND6，ATP6，ATP8，CYTB。14種tRNA 基因分別為tRNA-Ile，tRNA-Met，tRNA-Trp，tRNA-Leu，tRNA-Lys，tRNA-Asp，tRNA-Gly，tRNA-Ala，tRNA-Arg，tRNA-Asn，tRNA-Ser，tRNA-Glu，tRNA-Thr，tRNA-Ser。N 鏈編碼剩余的4種蛋白質(zhì)(ND1，ND4，ND4L，ND5)和2種線粒體核糖體RNA(12S rRNA，16S rRNA)，以及8種tRNA 基因(tRNA-Gln，tRNA-Cys，tRNA-Tyr，tRNA-Phe，tRNA-Pro，tRNA-Leu，tRNA-His，tRNAVal)。但也有些種類存在著重排現(xiàn)象，其中比較普遍的現(xiàn)象是tRNA 基因的增加或者發(fā)生倒位，轉(zhuǎn)移到另一條鏈上。據(jù)GenBank 中的數(shù)據(jù)，狂蠅科Oestridae 的Dermatobia hominis 線粒體基因組中在tRNA-lys(K)和tRNA-asp(D)之間有一個(gè)額外的 tRNA-val(V)。實(shí)蠅科 Tephritidae 的Bactrocera carambolae，B.philippinensis和B.papayae的線粒體基因組中位于Cytb和ND1 之間的tRNA-ser(S)由經(jīng)典位置J 鏈上轉(zhuǎn)移到了N 鏈上。麗蠅科Calliphoridae 金蠅屬Chrysomya 的C.putoria、C.megacephala 的線粒體基因組中在A+T富含區(qū)靠近12S rRNA 基因的位置有一個(gè)額外的tRNA-ile 基因，這種現(xiàn)象被認(rèn)為是金蠅屬蠅類的的共性(Junqueira et al.，2004;Stevens et al.，2008)。低等的雙翅目如毫蚊科Trichoceridae 的Paracladura trichoptera 線粒體基因組的排序與典型的序列相比發(fā)生了巨大的變化，不僅涉及到tRNA 基因的位置，蛋白質(zhì)編碼基因的位置也發(fā)生了很大的變化。線粒體基因組包含的37個(gè)基因在理論上存在很大的重排的潛力，但雙翅目中特別是進(jìn)化地位較高的種重排現(xiàn)象并不頻繁，比較常見(jiàn)的現(xiàn)象是涉及個(gè)別tRNA 基因的重排。不同種共享重排序列可能預(yù)示著它們系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較近，而低等的雙翅目昆蟲(chóng)基因序列發(fā)生較大的改變可能預(yù)示著在進(jìn)化的早期產(chǎn)生了獨(dú)立的進(jìn)化分支。

圖1 典型的雙翅目昆蟲(chóng)線粒體基因組排列方式Fig.1 Typical arrangement in diptera

與其他動(dòng)物一樣，雙翅目昆蟲(chóng)線粒體基因組與核基因相比較，A+T含量很高。從整個(gè)線粒體基因組上來(lái)看，即使含量最低的Bactrocera oleae，A+T含量也達(dá)到了72.7%(Nardi et al.，2003)，而含量最高的癭蚊Rhopalomyia pomum 高達(dá)85.2%(Beckenbach et al.，2009)。在37個(gè)基因中，13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因總體上A+T含量略低于整個(gè)基因組。如埃及伊蚊Aedes aegypti 的線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的A+T含量為77.1%，略低于78.9%的平均值(Behura et al.，2011)。2 條鏈上蛋白質(zhì)編碼區(qū)的堿基組成存在不對(duì)稱現(xiàn)象，如在Bactrocera oleae 基因組中，J 鏈上A和T 堿基的百分比非常接近(33.1±2.5%和35.9±1.7%)，但是在N鏈上T 堿基的百分比比A 大得多(48.6±1.5%和25.8±1.7%)。這種鏈間堿基含量的差異可能對(duì)其中編碼基因的核苷酸替換產(chǎn)生一定的選擇壓力(Nardi et al.，2003)。在密碼子方面，第三位密碼子A+T的含量非常高，而且比第一、二位密碼子高很多，如Liriomyza trifolii 第三位密碼子A+T的含量高達(dá)89.4%，而第一、二密碼子位上的A+T的含量分別是69.5%和67.4%(Wang et al.，2011)，可能的原因之一是絕大多數(shù)的密碼子本身就以A/T 結(jié)尾，如在黑腹果蠅的七個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中包含2097個(gè)密碼子，其中有1987個(gè)(約94.3%)是以A/T 結(jié)尾(Garesse，1988)，此外還有可能是第三位密碼子上相對(duì)較低的選擇和突變壓力(Jermiin et al.，1994)。

2 mtDNA 基因組中蛋白質(zhì)編碼基因、tRNA、rRNA和非編碼區(qū)的一般屬性

2.1 蛋白質(zhì)編碼基因

雙翅目昆蟲(chóng)mtDNA 中的蛋白質(zhì)編碼基因和其他動(dòng)物的線粒體一樣是13個(gè)。已知62種雙翅目昆蟲(chóng)的mtDNA 中最大的基因是ND5，長(zhǎng)度在1665～1746 bp 之間，癭蚊R.pomum 的ND5 最短，致倦庫(kù)蚊Culex quinquefasciatus 的最長(zhǎng)(Behura et al.，2011)。最小的基因是ATP8，在153～180 bp 之間。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中變化最小的是COI，已知62種中有61種該基因在1531～1540 bp 之間，而該基因最長(zhǎng)存在于食蚜蠅Simosyrphus grandicornis，為1558 bp(Cameron et al.，2007)，Rhopalomyia pomum 中唯一沒(méi)有縮短的蛋白質(zhì)的基因就是COI(Beckenbach et al.，2009)。

線粒體編碼的13個(gè)蛋白質(zhì)基因都是參與氧化磷酸化作用的功能基因。這些功能基因并非絕對(duì)的保守，而是有非常多的突變位點(diǎn)。由于氨基酸密碼子的簡(jiǎn)并性，許多在第三位和一些第一位置的堿基受到限制比較小，這些位置發(fā)生的轉(zhuǎn)換常常是沉默的，它們的改變并不能影響所編碼的氨基酸的種類。在6種按蚊的蛋白質(zhì)編碼基因(PCGs)中共有795個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)，其中94%是沉默性的，不能改變所編碼的氨基酸的種類，有674個(gè)突變發(fā)生在第三位的密碼子上(Krzywinski et al.，2010)。在蛋白質(zhì)編碼基因中，單個(gè)核苷酸的改變是由轉(zhuǎn)換或顛換引起的，親緣關(guān)系近的種間的替換形式主要是轉(zhuǎn)換，如Drosophila simulans和D.mauritiana，而親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種間替換的形式以顛換居多，如黑腹果蠅和亞庫(kù)巴果蠅之間，這可能是由于轉(zhuǎn)換引起的核苷酸水平上的改變是同義性的，而顛換引起的改變是非同義性的(Satta et al.，1987)。在這13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中不同的基因變異情況不同，總體上來(lái)說(shuō)COI-III 是相對(duì)保守的，變化大的是NADH 的幾個(gè)亞基。對(duì)12種果蠅的蛋白質(zhì)編碼基因研究顯示它們都受到了強(qiáng)的進(jìn)化選擇的壓力，氨基酸變異率分別是NADH(0.059)＞ATP(0.042)＞Cytb(0.037)＞COI-III(0.020)(Clark et al.，2007)。

雙翅目昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)編碼基因的起始密碼子一般是ATN，但COI 基因的起始密碼子比較特殊，如 TCG(Sperling et al.，1994;Weigl et al.，2010)、CCG(Andrianov et al.，2010)、ATAA(de Bruijn，1983)、ATCA(Behura et al.，2011)、GTGA(Satta et al.，1987)、GTAA(Satta et al.，1987)、ATTTAA(Mitchell et al，1993;Beard et al，1994)，然而精確地定義某物種的COI 起始密碼子還有賴于翻譯后產(chǎn)生的氨基酸序列與初始的核苷酸序列之間的比較分析(Spanos et al.，2000)。這些特殊的密碼子在參與后來(lái)的蛋白質(zhì)翻譯的過(guò)程中，先轉(zhuǎn)錄為mRNA 后經(jīng)RNA 的編輯轉(zhuǎn)換成正常的起始密碼子完成翻譯過(guò)程(Clary ＆Wolstenholme，1985)。蛋白質(zhì)的終止子有常見(jiàn)的有四種類型，分別為正常的TAA、TAG和兩個(gè)不完整的終止子TA和T。如潛葉蠅Liriomyza sativae 的線粒體DNA 的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中有10個(gè)的終止子是正常的TAA、TAG，另外ND5 的終止子是TA，ND2和Cytb 的終止子是T(Yang et al.，2011)。Bactrocera oleae 的mtDNA 中，有9個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的終止子為T(mén)AA，ND3和Cytb 則為T(mén)AG，而ND1和COI 分別以T/TA 作為終止子(Nardi et al.，2003)。雙翅目mtDNA 編碼的幾個(gè)基因如ND3-ND5，COII，Cytb 中，終止密碼子常常是不完整的TA 或T(Lessinger and Azeredo-Espin，2000;Oliveira et al.，2008)，這些不完整的終止子經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后的編輯，對(duì)不完整的終止子進(jìn)行多聚腺苷酸化便能形成完整的終止子TAA(Yokobori et al.，1997)。mtDNA 由于其獨(dú)特的堿基組成，在密碼子的使用上有明顯的偏向，如麗蠅Calliphora putoria 的13個(gè)線粒體編碼的蛋白質(zhì)基因沒(méi)有用CTG、CGC、AGG。對(duì)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)分析表明，螺旋蠅Cochliomyia hominivorax和黑腹果蠅中沒(méi)有使用CTG 等，這些GC 含量高的密碼子沒(méi)有被使用可能是mtDNA 基因組中GC堿基含量低的原因之一(Junqueira et al.，2004)。

2.2 tRNA 基因

雙翅目昆蟲(chóng)的mtDNA 編碼的tRNA 基因一般都能形成三葉草型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但tRNA-ser 的二級(jí)結(jié)構(gòu)常缺少DHU 臂而不能形成典型的三葉草型形狀，如亞庫(kù)巴果蠅(Clary et al.，1983)、麗蠅Calliphora putoria(Junqueira et al.，2004)。對(duì)已知62個(gè)物種的tRNA 統(tǒng)計(jì)分析顯示，其大小絕大部分在60～72 bp 之間，但也有特殊情況，如癭蚊科的Rhopalomyia pomum 的tRNA 基因缺少TψC stem-loop 結(jié)構(gòu)和3'端的氨酰基接受臂，22個(gè)tRNA 中長(zhǎng)度最小的只有41 bp，而缺失的氨?；邮鼙劭赡芡ㄟ^(guò)RNA 編輯，以5'端酰胺基接受臂為模板形成完整的氨基酸臂(Beckenbach et al.，2009)。雙翅目昆蟲(chóng)的mtDNA 中tRNA 基因的個(gè)數(shù)一般是22個(gè)，也有特殊的情況，如Liriomyza trifolii，在A+T富含區(qū)靠近12S rRNA 的一側(cè)出現(xiàn)了兩個(gè)額外的tRNA 基因tRNA-thr和tRNA-leu(Wang et al.，2011)。tRNA 基因中最保守的地方是氨酰基接受臂，反密碼子環(huán)和反密碼子臂，其他的區(qū)域大小變化較大，如在果蠅Drosophila yakuba 中氨?；邮鼙邸⒎疵艽a子環(huán)和反密碼子臂的長(zhǎng)度都是固定的，分別是7 bp、7 bp、5 bp，而其他部位如二氫尿嘧啶環(huán)(3～8 bp)、TψC 環(huán)(3～8 bp)多變環(huán)(4～5 bp)等(Clary and Wolstenholme，1985)。tRNA 基因中還存在這一些非Watson-Crick(DNA雙螺旋)的錯(cuò)配堿基存在，如在潛葉蠅Liriomyza sativae 的22個(gè)tRNA 基因中共含有27個(gè)錯(cuò)配的堿基，其中G-U21個(gè)，U-U4個(gè)，A-A1個(gè)，A-C 1個(gè)，分別是氨酰基接受臂8個(gè)，DHU 臂10個(gè)，AC 臂5個(gè)，DHU 臂4個(gè)(Yang et al.，2011)。不同的物種中tRNA 的進(jìn)化速率是有一定的變化，如在親緣關(guān)系較近的黑腹果蠅組(簇)7個(gè)種中，共有3種tRNA 的進(jìn)化速率存在相當(dāng)大的差異，這種速率的差異可能與緊鄰蛋白編碼基因的tRNA 在蛋白處理過(guò)程中的斷續(xù)性規(guī)則(punctuational role)有關(guān)(Nigro et al.，1991)。

2.3 rRNA 基因

雙翅目昆蟲(chóng)mtDNA 編碼的rRNA 基因與其他昆蟲(chóng)一致也有2個(gè)rRNA。其中一個(gè)較大的16S rRNA和一個(gè)較小的12S rRNA。90%的16S rRNA大小在1310～1350 bp 之間，但也有特例，癭蚊Rhopalomyia pomum 16S rRNA 基因只有1264 bp(Beckenbach et al.，2009)，而達(dá)林按蚊Anopheles darlingi 中，長(zhǎng)度達(dá)到1394 bp(Moreno et al.，2010)。兩種rRNA 基因在線粒體基因組中都是以單拷貝形式存在的。rRNA 基因的進(jìn)化速率與功能相關(guān)，核糖體蛋白結(jié)合位點(diǎn)、mRNA 結(jié)合位點(diǎn)和軸心螺旋等是其發(fā)揮功能的主要作用區(qū)域，屬于高保守區(qū)。rRNA 分子莖中長(zhǎng)莖比短莖保守，短莖又比環(huán)保守些。在12S rRNA 中，3'端比5'端要保守的多，對(duì)6種果蠅的12S rRNA 研究顯示，12S亞基3'端的進(jìn)化速率比5'端慢得多，即使經(jīng)過(guò)了3000～6000萬(wàn)年的進(jìn)化，其分類單元之間的平均遺傳距離依然非常近。這也進(jìn)一步證明了rRNA 基因的核苷酸序列的變異是由嚴(yán)格的結(jié)構(gòu)和功能限制所導(dǎo)致的，而不是簡(jiǎn)單的突變率減少(Simon et al.，1994)。

2.4 A+T富含區(qū)

雙翅目mtDNA 中位于12S rRNA和tRNA-ile之間的區(qū)域，A、T 兩種堿基的含量異常豐富，如黑腹果蠅的A、T 兩種堿基的含量高達(dá)96%，稱做A+T富含區(qū)。A+T富含區(qū)的長(zhǎng)度在不同的物種變化非常大，甚至在種內(nèi)不同個(gè)體之間也存在著差異。如角蠅Haematobia irritans 中，出現(xiàn)了3種不同的基因型(Oliveira et al.，2006)，這主要與重復(fù)單元的長(zhǎng)度和拷貝數(shù)的變化有關(guān)(Solignac et al.，1986;Monforte et al.，1993)。A+T富含區(qū)是線粒體基因組中進(jìn)化速率最快的區(qū)域，對(duì)果蠅屬DNA 序列的比較分析表明，大部分物種A+T富含區(qū)序列的分歧非常顯著(Clary et al.，1987)，但A+T富含區(qū)內(nèi)也有許多個(gè)保守片段。Lessinger等對(duì)引起蠅蛆病的五種雙翅目昆蟲(chóng)的A+T富含區(qū)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)了8個(gè)保守片段(CSBs)(Lessinger et al.，2000)，而這8個(gè)保守性片段也存在麗蠅科中(Lessinger et al.，2004)。Oliveira 等在蠅科的幾個(gè)種如西方角蠅Haematobia irritans，家蠅Musca domestica，廄蜇蠅Stomoxys calcitrans和東方芒蠅Atherigona orientalis 中發(fā)現(xiàn)了這8個(gè)片段中的7個(gè)，其中前3種缺少CSB3，而在東方芒蠅中缺少CSB7(Oliveira et al.，2007)。Zhang 等總結(jié)的多聚T片段相當(dāng)于CSB1，［TA(A)］n片段相當(dāng)于CSB6(Zhang et al.，1997)。Oliveira 等對(duì)蠅科的4個(gè)種、麗蠅科的5個(gè)種、果蠅科的7個(gè)種、狂蠅科的1種的A+T富含區(qū)綜合分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了短角亞目中4個(gè)保守區(qū)(BCRs)和Gisland(Oliveira et al.，2007)。A+T富含區(qū)作為mtDNA 中最大的非編碼區(qū)與mtDNA 的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。Clary 等認(rèn)為位于MQI 基因附近的多聚T片段有促進(jìn)朝著tRNA基因簇方面轉(zhuǎn)錄的起始的識(shí)別作用(Clary et al.，1987)。Saito 等將果蠅線粒體DNA 兩條鏈復(fù)制的起始精確定位于兩個(gè)多聚T片段下游的第一個(gè)堿基(Saito et al.，2005)。Goddard 等通過(guò)電鏡技術(shù)將果蠅線粒體DNA 復(fù)制的起始定位在A+T富含區(qū)內(nèi)一個(gè)300 bp 的保守區(qū)(Goddard et al.，1978;1980)。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著技術(shù)的不斷成熟，利用mtDNA 中所蘊(yùn)含的分子數(shù)據(jù)來(lái)研究昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)已成為一大熱點(diǎn)，多種分子數(shù)據(jù)聯(lián)合分析對(duì)單基因的優(yōu)越性已經(jīng)被廣泛接受，如線粒體不同的基因間，線粒體與和核基因間。在昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)研究中，更重要的是利用哪些基因解決哪些問(wèn)題，及如何恰當(dāng)?shù)胤治龇肿訑?shù)據(jù)(陳學(xué)新等，2001)，這勢(shì)必會(huì)加速昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展。然而在分子生物學(xué)迅猛發(fā)展的今天，我們也不能忘記傳統(tǒng)意義上系統(tǒng)學(xué)的作用。僅僅利用分子數(shù)據(jù)分析物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系有時(shí)會(huì)得出非?；闹嚨慕Y(jié)論，特別是在還沒(méi)確定哪些基因?qū)δ男﹩?wèn)題起作用的今天。分子數(shù)據(jù)也可以解決形態(tài)學(xué)上難以區(qū)分的物種，是對(duì)傳統(tǒng)分類學(xué)的一個(gè)有益的補(bǔ)充(葛振萍等，2007)。傳統(tǒng)意義上的形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)相結(jié)合，會(huì)得出更科學(xué)的結(jié)論，勢(shì)必成為雙翅目昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)未來(lái)的發(fā)展方向。

References)

Chen XX，2001.Insect Molecular Science.Beijing:China Science Press.1-44.［陳學(xué)新，2001.昆蟲(chóng)分子科學(xué).北京:科學(xué)出版社.1-44］

Chi Y，Wang SD，Zhang CT，2010.Advance of Diptera based on mitochondrial COI gene.Entomotaxonomia(Suppl.)，8:71-77.［池宇，王詩(shī)迪，張春田，2010.基于線粒體COI 基因的雙翅目昆蟲(chóng)研究進(jìn)展.昆蟲(chóng)分類學(xué)報(bào)(增刊)，8:71-77］

Ge ZP，Liu JY，Zhang CT，2007.Progress of studies on molecular systematics of flies(Diptera).Journal of Shenyang Normal University(Natural Science Edition)，25(2):233-236.［葛振萍，劉家宇，張春田，2007.雙翅目蠅類的分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展.沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，25(2):233-236］

Xu QG，Hua BZ，2001.Application of mtDNA in phylogenetic analysis of insects.Journal of Northwest A ＆ F University(Natural Science Edition)，29(1):79-83.［徐慶剛，花保禎，2001.線粒體DNA 在昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，29(1):79-83］

Andrianov BV，Goryacheva II，Mugue NS，Sorokina SY，Gorelova TV，Mitrofanov VG，2010.Comparative analysis of the mitochondrial genomes in Drosophila virilis species group(Diptera:Drosophilidae).Trends.Evol.Biol.，2(e4):22-31.

Beard CB，Mills Hamm D，Collins FH，1993.The mitochondrial genome of the mosquito Anopheles gambiae:DNA sequence，genome organization，and comparisons with mitochondrial sequences of other insects.Insect Mol.Biol.，2:103-124.

Beckenbach AT，Joy JB，2009.Evolution of the mitochondrial genomes of Gall Midges(Diptera:Cecidomyiidae):rearrangement and severe truncation of tRNA genes.Genome Biology Evolution，1:278-287.

Behura SK，Lobo NF，Haas B，deBruyn B，Lovin DD，Shumway MF，Puiu D，Romero-Severson J，Nene V，Severson DW，2011.Complete sequences of mitochondria genomes of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus and comparative analysis of mitochondrial DNA fragments inserted in the nuclear genomes.Insect Biochem.Mol.Biol.，41(10):770-777.

Boore JL，1999.Animal mitochondrial genomes.Nucleic Acids Res.，27(8):1767-1780.

Cameron SL，Lambkin CL，Barker SC，Whiting MF，2007.A mitochondrial genome phylogeny of Diptera:whole genome sequence data accurately resolve relationships over broad timescales with high precision.Syst.Entomol.，32(1):40-59.

Clark AG，Eisen MB，Smith DR，et al.，2007.Evolution of genes and genomes on the Drosophila phylogeny.Nature，450，203-218.

Clary DO，Wahleithner JA，Wolstenholme DR，1983.Transfer RNA genes in Drosophila mitochondrial DNA: related 5'flanking sequences and comparisons to mammalian mitochondrial tRNA genes.Nucleic Acids Res.，11(8):2411-2425.

Clary DO，Wolstenholme DR，1985.The mitochondrial DNA molecular of Drosophila yakuba:nucleotide sequence，gene organization，and genetic code.J.Mol.Evol.，22(3):252-271.

Clary DO，Wolstenholme DR，1987.Drosophila mitochondrial DNA:conserved sequences in the A+T-rich region and supporting evidence for a secondary structure model of the small ribosomal RNA.J.Mol.Evol.，25:116-125.

de Bruijn MH，1983.Drosophila melanogaster mitochondrial DNA，a novel organization and genetic code.Nature，304，234-241.

Garesse R，1988.Drosophila melanogaster mitochondrial DNA:gene organization and evolutionary considerations.Genetics，118(4):649-663.

Goddard JM，Wolstenholme DR，1978.Origin and direction of replication in mitochondrial DNA molecules from Drosophila melanogaster.Proc.Natl.Acad.Sci.，75:3886-3890.

Goddard JM，Wolstenholme DR，1980.Origin and direction of replication in the mitochondrial DNA molecules from the genus Drosophila.Nucleic Acids Res.，8:741-757.

Jermiin LS，Graur D，Lowe RM，Crozier RH，1994.Analysis of directional mutation pressure and nucleotide content in mitochondrial cytochrome b genes.J.Mol.Evol.，39:160-173.

Junqueira AC，Lessinger AC，Torres TT，Silva FR da，Vettore AL，Arruda P，Espin AMLA，2004.The mitochondrial genome of the blowfly Chrysomya chloropyga(Diptera:Calliphoridae).Gene，339:7-15.

Krzywinski J，Li C，Morris M，Conn JE，Lima JB，Povoa MM，Wilkerson RC，2010.Analysis of the evolutionary forces shaping mitochondrial genomes of a Neotropical malaria vector complex.Mol.Phylogenet.Evol.，58(3):469-477.

Kutty SN，Pape T，Pont A，Wiegmann BM，Meier R，2008.The Muscoidea(Diptera:Calyptratae)are paraphyletic:evidencefrom four mitochondrial and four nuclear genes.Mol.Phylogenet.Evol.，49(2)，639-652.

Kutty SN，Pape T，Wiegmann BM，Meier R，2010.Molecular phylogeny of the Calyptratae(Diptera:Cyclorrhapha)with an emphasis on the superfamily Oestroidea and the position of Mystacinobiidae and McAlpine's fly.Systematic Entomology，35(4):614-635.

Lessinger AC，Azeredo-Espin AML，2000.Evolution and structural organization of mitochondrial DNA control region of myiasis-causing flies.Med.Vet.Entomol.，14:71-80.

Lessinger AC，Junqueira ACM，Conte FF，Azeredo-Espin AML，2004.Analysis of a conserved duplicated tRNA gene in the mitochondrial genome of blowflies.Gene，339:1-6.

Lessinger AC，Martins-Junqueira AC，Lemos TA，Kemper EL，da Silva FR，Vettore AL，Arruda P，Azeredo-Espin AM，2000.The mitochondrial genome of the primary screwworm fly Cochliomyia hominivorax(Diptera:Calliphoridae).Insect Mol.Biol.，9(5):521-529 .

Lewis DL，F(xiàn)arr CL，F(xiàn)arquhar AL，Kaguni LS，1994.Sequence，organization，and evolution of the A+Tregion of Drosophila melanogaster mitochondrial DNA.Mol.Biol.Evol.，11:523-538.

Mitchell SE，Cockburn AF，Seawright JA，1993.The mitochondrial genome of Anopheles quadrimaculatus species A: complete nucleotide sequence and gene organization.Genome，36:1058-1073.

Monforte A，Barrio E，Latorre A，1993.Characterization of the length polymorphism in the A+T-rich region of the Drosophila obscura group species.J.Mol.Evol.，36:214-223.

Moreno M，Marinotti O，Krzywinski J，Tadei WP，James AA，Achee NL，Conn JE，2010.Complete mtDNA genomes of Anopheles darlingi and an approach to anopheline divergence time.Malar.J.，9:127.

Nardi F，Carapelli A，Dallai R，F(xiàn)rati F，2003.The mitochondrial genome of the olive fly Bactrocera oleae:two haplotypes from distant geographical locations.Insect Mol.Biol.，12(6):605-611.

Nigro L，Solignac M，Sharp PM，1991.Mitochondrial DNA sequence divergence in the Melanogaster and oriental species subgroups of Drosophila.J.Mol.Evol.，33:156-162.

Oliveira MT，Azeredo-Espin AML，Lessinger AC，2007.The mitochondrial DNA control region of Muscidae flies:evolution and structural conservation in a Dipteran context.J.Mol.Evol.，64:519-527.

Oliveira MT，Barau JG，Junqueira AC，F(xiàn)eijao PC，Rosa AC，Abreu CF，Azeredo-Espin AM，Lessinger AC，2008.Structure and evolution of the mitochondrial genomes of Haematobia irritans and Stomoxys calcitrans: the Muscidae(Diptera: Calyptratae)perspective.Mol.Phylogenet.Evol.，48(3):850-857.

Oliveira MT，da Rosa AC，Azeredo-Espin AML，Lessinger AC，2006.Improving access to the control region and tRNA geneclusters of dipteran mitochondrial DNA.J.Med.Entomol.，43:636-639.

Saito S，Tamura K，Aotsuka T，2005.Replication origin of mitochondrial DNA in insects.Genetics，171:1695-1705.

Satta Y，Ishiwa H，Chigusa SI，1987.Analysis of nucleotide substitutions of mitochondrial DNAs in Drosophila melanogaster and its sibling species.Mol.Biol.Evol.，4(6):638-650.

Schroeder H，Klotzbach H，Elias S，Augustin C，Pueschel K，2003.Use of PCR-RFLP for differentiation of calliphorid larvae(Diptera，Calliphoridae)on human corpses.Forensic Sci.Int.，132:76-81.

Simon C，F(xiàn)arti F，Beckenbach AC，1994.Evolution，weihgting and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequence and compilation of conserved polymerase chain reaction primers.Ann.Entomo.Soc.Am.，87:651-701.

Solignac M，Monnerot M，Mounolou JC，1986.Concerted evolution of sequence repeats in Drosophila mitochondrial DNA.J.Mol.Evol.，24:53-60.

Spanos L，Koutroumbas G，Kotsyfakis M，Louis C，2000.The mitochondrial genome of the mediterranean fruit fly，Ceratitis Capitata.Insect Mol.Biol.，9(2):139-144.

Sperling FA，Anderson GS，Hickey DA，1994.A DNA-based approach to the identiflcation of insect species used for postmortem interval estimation.Journal of Forensic Sciences，39:418-427.

Stevens JR，West H，Wall R，2008.Mitochondrial genomes of the sheep blowfly，Lucilia sericata，and the secondary blowfly，Chrysomya megacephala.Med.Vet.Entomol.，22:89-91.

Wang S，Lei Z，Wang H，Dong B，Ren B，2011.The complete mitochondrial genome of the leafminer Liriomyza trifolii(Diptera:Agromyzidae).Mol.Biol.Rep.，38(2):687-692.

Weigl S，Testini G，Parisi A，Dantas-Torres F，Traversa D，Colwell DD，Otranto D，2010.The mitochondrial genome of the common cattle grub，Hypoderma Lineatum.Med.Vet.Entomol.，24(3):329-335.

Wiegmann BM，Trautwein MD，Winkler IS，et al.，2011.Episodic radiations in the fly tree of life.PNAS，108(14):5690-5695.

Wiegmann BM，Yeates DK，Thorne JL，Kishino H，2003.Time flies，a new molecular time-scale for brachyceran fly evolution without a clock.Syst.Biol.，52(6):745-756.

Yang F，Du YZ，Wang LP，Cao JM，Yu WW，2011.The complete mitochondrial genome of the leafminer Liriomyza sativae(Diptera:Agromyzidae):Great difference in the A+T-rich region compared to Liriomyza trifolii.Gene，485(1):7-15.

Yokobori S，P??bo S，1997.Polyadenylation creates the discriminator nucleotide of chicken mitochondrial tRNA(Tyr).J.Mol.Biol.，265:95-99.

Zhang DX，Hewitt GM，1997.Insect mitochondrial control region:a review of its structure，evolution and usefulness in evolutionary studies.Biochem.Syst.Ecol.，25:99-120.