r-hFSH制備卵巢過度刺激綜合征動物模型①

李 權，徐 敏，李 艷，李清漢

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產科，貴州 遵義 563000)

輔助生殖技術目前已經成為治療不孕癥的重要治療手段，使先前認為不能生育的夫婦擁有健康的子女，但是輔助生殖的并發(fā)癥——卵巢過度刺激綜合征是其主要的并發(fā)癥，國內報道，卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的發(fā)生率為23.3% ，其中重度為1% ～2%［1］。因其發(fā)生相對治療來說相對滯后，由于倫理因素難以在人體進行，嚴重地制約該病的研究。目前國內外均有注射馬促腺性激素建立大鼠卵巢過度刺激綜合征的動物模型，且已用該模型對馬促腺性激素的發(fā)病及治療進行相關的研究，取得了一定的效果。但因目前國內外對馬促腺性激素的生產已經停止，獲取馬促腺性激素相對較困難，需要尋找另一種激素制備OHSS的動物模型，更好地探索OHSS藥物治療效果及其發(fā)生的具體機制，我們用重組人促卵泡激素(Recombinant Human Folli-tropin Alfa Solution for Injection，r～hFSH)刺激Wistar大鼠制備了OHSS的動物模型。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級未發(fā)育雌性Wistar大鼠22日齡，體重42.0～45.0g，購于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.2 EB 染料 Evens blue(EB，Sigma);Recombinant Human Follitropin Alfa Solution for Injection(rhFSH，Merck Seromno S.p.A.);human chorionic gonadot rophin(hCG;麗珠集團麗珠制藥廠)。

1.3 方法 將20只22日齡雌性Wistar大鼠隨機分成兩組，每組10大鼠。實驗組10只未發(fā)育雌性Wistar大鼠在第22～25日齡每日上午08∶30均腹腔注射10IU r～hFSH(用0.1 ml NS稀釋)，第26日齡上午08∶30皮下注射hCG 30 IU(用0.1 ml NS稀釋);對照組10只未發(fā)育雌性Wistar大鼠在第22～26日齡每日上午08∶30均腹腔注射0.1 ml NS。實驗組與對照組在第28日齡上午08∶30經尾靜脈注射1%EB染料0.1 ml，30 min脫頸法處死大鼠后立即腹水評分，無腹水或少量腹水者向腹腔灌注5 ml NS，灌注液收集10 ml試管中，均稀釋到10 ml，再加入 0.05 ml 0.1 NaOH 液，以1000 r/min的速度在室溫下離心10 min，用721分光光度計在波長600 nm處行比色測定，記錄OD值。

1.4 觀察指標

1.4.1 腹腔毛細血管通透性 根據標準濃度及其OD值繪制標準曲線，算出腹腔沖洗液EB含量。

1.4.2 腹水評分 大鼠脫頸法處死后，切開腹壁，參考Leng［2］的方法進行腹水評分:1分:無腹水;2分:少量腹水存在;3分:中量腹水存在;4分:腹水明顯存在;5分:大量腹水存在或腹水從腹部切口溢出。

1.4.3 卵巢重量測量 取下雙側卵巢后立即用電子天平稱重并記錄其重量。

1.5 統(tǒng)計學分析 數據采用SPSS 11.0軟件進行分析，結果以均數 標準差(s)表示，差異比較采用完全隨機設計t檢驗，檢驗水準為0.05。

2 結果

實驗組Wistar大鼠與對照組Wistar大鼠在第22日齡是體重分別42.0±1.05g與42.0±1.06g，兩組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。兩組經過上述注射藥物(實驗組)或生理鹽水(對照組)后第28日齡時檢測腹腔EB含量、卵巢重量和腹水評分均有差異(P＜0.001)，(見表1)。

表1 兩組腹腔液中EB含量、卵巢重量和腹水評分比較(s)

表1 兩組腹腔液中EB含量、卵巢重量和腹水評分比較(s)

注:*:與對照組有差異，P＜0.001

組 別 腹腔液中EB含量(μg/ml)卵巢重量(mg)腹水評分實驗組 4.324 ±0.372*389.00 ±23.30 *2.43 ±0.34*對照組0.312 ±0.032 29.37 ±4.26 1.00 ±0.00

3 討論

OHSS是因為改變常發(fā)生在輔助生殖促排卵治療過程中，也偶發(fā)生在正常的多胎妊娠中，因此認為與促腺性激素有關，但在診斷前其發(fā)生仍有不可預知性，是輔助生殖過程中最嚴重的一種臨床綜合征，臨床表現主要包括卵巢增大、腹水及胸水，嚴重者因可出現生命危象而終止移植或放棄治療周期。目前OHSS發(fā)生的病理生理機制還沒有完全闡明，研究認為促排卵藥物刺激后引起卵巢分泌血管活性物質的釋放導致毛細血管通透性的增加是本病發(fā)生的關鍵因素［3］。由于常發(fā)生在輔助生殖過程中，由于倫理因素，OHSS的病理生理研究進展緩慢，需要復制動物模型進行相關的基礎研究。

國外的OHSS模型大多選擇恒河猴為造模對象［4］，但是價格昂貴，操作復雜，模型技術不易推廣;國內選擇未發(fā)育雌性Wistar大鼠以馬促腺性激素建立OHSS的動物模型獲得成功［5］，并在該動物模型上進行相關基礎研究和藥物試驗，均取得了較好的效果［6］。限于馬促腺性激素目前國內購買相對困難，而r-hFSH在臨床上廣泛應用，因此我們選擇用中國倉鼠卵細胞經遺傳工程生產的促腺性激素(r～hFSH)代替馬促腺性激素，參照付永倫等［5］的文獻建立OHSS的動物模型方法。研究結果顯示在促腺性激素與生理鹽水對照試驗前Wistar大鼠體重無明顯差異條件下，試驗組每日經r-hFSH刺激后hCG促排卵，對照組生理鹽水替代激素行相同的試驗過程。在hCG注射后48h，即Wistar大鼠第28日齡時比較兩組的卵巢重量、腹水評分和腹腔中EB濃度均有顯著性差異，表明腹腔通透性在實驗組明顯增加，卵巢體積因卵泡的發(fā)育和通透性增加使重量增加，體積增大，與付永倫等［5］用馬促腺性激素結果一致，與Golan［7］的卵巢過度刺激綜合征診斷標準相符，說明我們成功制備了OHSS模型。

建立OHSS的動物模型對該病進行基礎和臨床研究，是生殖醫(yī)師正確認識和研究超排卵導致OHSS病理生理和探討臨床治療的主要手段之一。該動物模型的成功制備，可以研究OHSS的發(fā)生發(fā)展及病理生理過程，可以為研究藥物對OHSS的治療效果提供方便有效的手段，我們正在利用該模型進行相關的病理生理的基礎研究。

［1］莊廣倫.現代輔助生育技術［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005，408-411.

［2］Leng P，Ho Yuen B，Moon YS.Effect of prolactin in an experimental model of the ovarian hyperstimulation syndrome［J］.Am J Obstet Gynecol，1983，145:847-849.

［3］Ohba T，Ujioka T，Ishikawa K，et al.Ovarian hyperstimulation syndrome model rats，the manifestation and clinical implication［J］.Molecular and Cellular Endocrinology ，2003，202:47-52.

［4］Molskness T A，Stouffer R L，Burry KA，et al.Circulating levels of free and total vascular endothelial growth factor(VEGF)-A，soluble VEGF receptors-1 and-2 ，and angiogenin during ovarian stimulation in nonhuman primates and women［J］.Hum Reprod，2004，19:822-830.

［5］付永倫，林其德，仲汗威.卵巢過度刺激綜合征大鼠模型建立［J］.上海實驗動物科學，2002，22(1):16-18.

［6］付永倫，林其德.RU486 OHS模型大鼠血管內皮生長因子產生的作用［J］.生殖與避孕，2005，25(5):263-267.

［7］Golan A，Ronel R，Soffer Y，et al.Ovarian hyperstimulation syndrome:an update review［J］.Obstet Gynecol Survey，1989，44:430-440.