淫羊藿苷對大鼠肝藥物代謝Ⅱ相酶和藥物轉運體的影響①

李利生，劉 娟，王安斌，陳 瀾，陸遠富，劉 杰，石京山

(1.貴州省基礎藥理重點實驗室暨遵義醫(yī)學院藥理教研室，貴州 遵義 563000;2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所，貴州 遵義 563000)

淫羊藿苷(icariin，ICA)為小檗科淫羊藿屬植物淫羊藿的主要活性成分，具有調節(jié)免疫和內分泌、治療男性勃起功能障礙和抗老年癡呆等藥理作用［1］。含淫羊藿的中藥復方或中成藥已經廣泛應用于臨床，而且老年人群中常需服用多種藥物，發(fā)生藥物相互作用的可能性相應增加。本研究探討了ICA對大鼠藥物代謝Ⅱ相酶谷胱甘肽－S轉移酶(glutathione S －transferase，GSTs)和尿苷 －5＇－二磷酸葡醛酰轉移酶(uridine 5＇－diphosphate glucuronosyl transferase，UGTs)以及藥物轉運蛋白有機陰離子轉運多肽(organic anion transporting polypeptide，Oatp)和有機陰離子轉運體(organic anion transporter，OAT)基因表達、活性或含量的影響，并比較了月齡的差異，為臨床特別是老年人群安全合理用藥提供指導，為ICA新藥開發(fā)提供藥動學基礎資料。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器 ICA(南京替斯艾么中藥研究所，純度＞98%);OAT2、Oatp2酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國R＆D systems);2－氨基酚、UDP－葡萄糖醛酸、谷胱甘肽(美國sigma);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所);Trizol、RNA純化試劑盒、RT－PCR試劑盒、β－actin、UGT1A6、UGT2B7、GST － π、OAT2、Oatp2mRNA 引物(大連寶生物工程有限公司)。Multiskan Spectrum全波長酶標儀(芬蘭Thermo);L－100XP冷凍超速離心機(美國Beckman Coulter);RNA逆轉錄儀(德國Eppendorf);UV－3010紫外可見分光光度計(日本日立公司);實時定量RT－PCR擴增儀(美國BIO－RAD)。

1.2 分組及給藥方案 6月齡(體重200～240 g)和18月齡(體重420～460 g)SD大鼠，♂，購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物中心，許可證號:SCXK(渝)2007－0005。適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為6月齡大鼠生理鹽水組(6NS)和ICA組(6ICA)，18月齡大鼠生理鹽水組(18 NS)和ICA組(18 ICA)，每組8只;ICA按60 mg·kg－1灌胃給藥，每天1次，連續(xù)28 d，生理鹽水組給予等體積生理鹽水。

1.3 鈣沉淀法提取肝微粒體并測定蛋白含量［2］

肝臟勻漿后離心，分離上清液加入鈣，冰浴后再離心(27 kg×15 min，4℃)，留取沉淀物加入400 μL Tris－ KCl重懸后離心(27 kg×15 min，4℃)，即得微粒體，棄上清液加入500 μL的PBS重懸。BCA法測微粒體蛋白含量。

1.4 肝微粒體酶學分析［2、3］GSTs可催化二硝基氯苯和谷胱甘肽為生成2，4－二硝基苯－谷胱甘肽復合物，產物的生成量反映酶活性，測定后者OD340 nm，根據(jù)公式計算酶活性:GST活性(μmol·L－1·min－1·mg－1)=OD340nm/9.6 × 蛋白濃度(9.6為2，4－二硝基苯－谷胱甘肽復合物的消光系數(shù))。肝微粒體UGTs活性測定以2－氨基酚為底物，紫外分光光度法測定，根據(jù)苯胺標準曲線計算酶活性，以“nmol苯胺·min－1·mg－1蛋白”表示。

1.5 OAT2和Oatp2含量測定 取肝組織勻漿，BCA法測定勻漿液中蛋白含量，將蛋白濃度稀釋為5 mg·mL－1，采用ELISA法測定OAT2和Oatp2含量，根據(jù)試劑盒說明書操作。

1.6 Real time RT － PCR 檢測 UGT1A6、UGT2B7、GST－π、OAT2、Oatp2 mRNA的表達 Trizol法提取RNA并純化，將RNA母液稀釋為50 ng·L－1用于逆轉錄，反應條件:37℃15 min，85℃5sec。逆轉錄所得cDNA經Real－Time RT－PCR進行擴增，反應條件:95℃，10 min(預變性);95℃ 10 sec(變性)，60℃1 min(復性)，40個循環(huán)。以內參基因為100%，目的基因相對表達量以“目的基因/內參基因”表示。各基因及其引物信息(見表1)。1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結果以均數(shù)±標準差(s)表示，同月齡大鼠組間比較采用t檢驗，ICA對藥物代謝Ⅱ相酶及藥物轉運體影響的月齡差異采用雙因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 β －actin、UGT1A6、UGT2B7、GST－π、OAT2和 Oatp2基因引物信息

2 結果

2.1 ICA對大鼠肝OAT2和Oatp2含量的影響圖1可見，與NS組比較，ICA組大鼠肝組織OAT2和Oatp2含量顯著增高(均P＜0.05)。6月齡和18月齡大鼠肝組織OAT2和Oatp2含量的增加幅度相當，ICA對OAT2和Oatp2含量的促進作用月齡間未見顯著差異。

2.2 ICA 對大鼠肝 UGT1A6、UGT2B7、GST － π、OAT2和Oatp2 mRNA表達的影響 與相應NS組比較，ICA組大鼠肝OAT2、Oatp2mRNA的表達顯著增高，但不同月齡間未見明顯差異。ICA對UGT1A6、UGT2B7、GST－π mRNA 的表達無明顯影響。ICA對上述基因表達的影響與相應的酶含量或活性的變化一致(見表2)。

圖1 ICA對大鼠肝OAT2和Oatp2含量的影響(s，n=8)

表2 ICA對大鼠肝UGT1A6、UGT2B7、GST－π、OAT2和Oatp2 mRNA表達的影響(x ± s，n=8)

2.3 ICA對大鼠肝微粒體UGTs、GSTs活性的影響 表3可見ICA對大鼠肝微粒體UGTs、GSTs活性無明顯影響(均P＜0.05)。

表3 ICA對大鼠肝藥酶部分亞型活性的影響(x ± s，n=8)

3 討論

從傳統(tǒng)意義上講，通過Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶介導的藥物代謝的改變是藥物相互作用的原因。但越來越多的研究表明，藥物轉運蛋白的改變也是導致藥物代謝消除改變的原因之一［4］。肝臟是富含藥物代謝酶和藥物轉運體的器官，是藥物代謝的主要場所，并有學者將轉運蛋白對藥物的作用稱為Ⅲ相代謝。參與Ⅰ相反應的CYP氧化酶、Ⅱ相反應的結合酶和藥物轉運蛋白可因某些藥物的影響而被誘導或抑制，是臨床藥物相互作用關注的重點。UGTs是Ⅱ相反應中最主要的酶系，分為參與酚和膽紅素代謝的UGT1家族和參與類固醇代謝的UGT2家族，哺乳動物UGTs負責數(shù)以百計的疏水性內源和外源化合物的葡醛酸化，其中UGT1A6和UGT2B7是已知代謝外源性底物較多且在肝臟均有表達的亞型［5］。本研究發(fā)現(xiàn)ICA對UGTs活性和UGT1A6、UGT2B7 mRNA的表達無明顯影響，提示在臨床上與其他藥物如嗎啡、對乙酰氨基酚合用時，不會對后者的代謝產生影響。

許多藥物經過Ⅰ相代謝的產物需與谷胱甘肽結合生成強極性物質經腎臟或膽汁排泄。催化谷胱甘肽結合反應的酶為GSTs，位于肝、腎等組織的細胞液中。根據(jù)其基因序列的保守性和免疫交叉活性分為α、μ、π和θ等亞型。肝臟是富含GST－π 的器官［6、7］。ICA 對大鼠肝組織中 GST－ π mRNA的表達和GSTs活性未見顯著影響，與其他藥物合用時不需考慮其對GSTs的影響所導致的藥物間相互作用。

藥物的體內過程受生物膜的影響，藥物能否通過生物膜不僅取決于藥物的理化性質，而且受轉運蛋白的影響。Oatp是轉運內源性和外源性化合物的膜蛋白［8］，可將多種藥物從血液向膽汁轉運，在Oatp家族成員中，Oatp2在肝組織大量表達，介導膽汁酸、強心苷、他汀類藥物的轉運［9］，ICA上調肝組織Oatp2 mRNA的表達，增加Oatp2的含量，進而促進Oatp2的底物向膽汁運輸，但ICA對脈絡叢和視網(wǎng)膜色素上皮細胞的Oatp2的表達是否具有類似作用有待進一步研究。OAT蛋白在肝臟、腎臟和腦部表達，有三個主要成員，其中OAT2只在肝臟表達，已知的底物包括甲氨蝶呤、水楊酸鹽等［10］。給予大鼠ICA后OAT2的含量明顯增加，OAT2 mRNA的表達也呈一致改變，表明ICA對OAT2具有誘導作用，可能影響經OAT2轉運的藥物的體內過程。ICA對OAT其他亞型的影響待深入研究。

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