人參皂苷Rg1對大鼠血管球囊損傷后原癌基因c-myc表達的影響①

高 楊，鄧 江，黃燮南

(遵義醫(yī)學院藥理學教研室暨貴州省基礎藥理重點實驗室，貴州 遵義 563000)

人參皂苷Rg1(Rg1)為我國名貴中藥材人參 (panax ginseng C.A.Mayer)干燥根的主要活性成分之一［8］。研究表明，在離體實驗的條件下，Rg1可抑制腫瘤壞死因子-α所致血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖［1，2］;我們的既往也發(fā)現(xiàn)，Rg1具有抑制球囊損傷所致大鼠頸動脈內膜增生［3］等作用。有學者認為，VSMC增殖需要原癌基因 c-myc轉錄的增加［4，5］，但 Rg1 能否影響c-myc基因的轉錄還不清楚。本研究旨在利用球囊損傷所致頸動脈狹窄模型，探討Rg1抗血管新生內膜增生作用與原癌基因c-myc表達的關系。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器 主要藥品、試劑、儀器及其來源如下:Rg1(純度95%，北京天然藥物研究院)、c-myc和β-actin引物(TaKaRa生物工程公司)、High-Capacity CDNA逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems)、SYBR(r)GREEN PCR Master Mix(Warrington WA14SR.UK)、RNA 純化試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)、2F球囊導管(美國edwards lifescience公司)、Leica光學顯微鏡及照相系統(tǒng)(德國 Leica Microsystems Ltd)、實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)、RNA逆轉錄儀(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠35只，體重325±25 g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供(許可證號:SCXK-(軍)2007-017)。

1.3 大鼠頸總動脈球囊損傷模型制備及動物分組動物禁食12 h，用20%水合氯醛0.2 ml/100 g腹腔注射麻醉后固定。切開頸部正中皮膚，分離左側頸總動脈及頸外動脈，結扎頸外動脈遠心端，將2F球囊導管從頸外動脈近心端插入至頸總動脈起始部。注入約0.1 ml生理鹽水使球囊充盈，然后緩慢來回推拉球囊導管3次以剝脫頸動脈內皮，然后退出導管，結扎左頸外動脈，縫合切口。術后注射12萬U/只芐星青霉素預防感染，清醒后置籠喂養(yǎng)。將大鼠隨機分為假手術(頸部皮膚切開但不插球囊導管)組、模型組、造模后給Rg14和16 mg/kg兩組。術后次日開始腹腔注射給藥，模型組與假手術組給予等體積生理鹽水。連續(xù)給藥14 d后再次麻醉大鼠，迅速取出損傷的左頸總動脈，生理鹽水洗凈，取中間段放入10%中性福爾馬林中固定24 h，石蠟包埋后用于形態(tài)學觀察。剩余標本置液氮中速凍，然后放-70℃冰箱中凍存用于realtime RT-PCR檢測。

1.4 血管腔面積的測定 常規(guī)石蠟包埋切片后，行蘇木精-伊紅(H.E.)染色，Leica光學顯微鏡下觀察血管腔狹窄情況，拍照記錄后用Q Win圖像處理與分析系統(tǒng)測定管腔面積。每個標本觀察3張切片，取平均值。

1.5 real-time RT-PCR檢測VSMC中c-myc mRNA的表達 取冷凍血管標本置于0.5 ml trizol液中，充分勻漿至組織完全裂解，按照trizol試劑盒說明書提取RNA，純化后進行樣品純度鑒定。兩步法逆轉錄-聚合酶鏈反應如下:從基因庫GeneBank中查出相關引物序列，由TaKaRa生物工程公司合成相應引物(見表1)。PCR反應體系為20 μl第一步，95℃ ×10 min;第二步，95℃ ×15 s，退火溫度 ×1 min，循環(huán)45次。結果分析處理(相對定量法)，以Ct值為統(tǒng)計參數(shù)依次計算下列數(shù)據(jù):① Ct平均值=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重復管);② dCt=Ct平均值-中間值;③基因的表達=2^(-dCt);④相對定量=目的基因的表達/內參基因的表達。

表1 real-time RT-PCR的引物序列

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，各項指標均采用均數(shù)±標準差(s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Rg 1對大鼠頸動脈球囊損傷后管腔面積的影響 H.E.染色切片經(jīng)圖像分析的結果表明，模型組在球囊損傷后血管腔面積僅為假手術組的31.1%左右。Rg1低劑量組和Rg1高劑量組管腔狹窄程度均較模型組明顯減輕 (P＜0.05)，已分別恢復到假手術組的63.9%和90.8%(見圖1)。

2.2 Rg1對大鼠頸動脈球囊損傷后血管壁c-myc mRNA表達的影響球囊擴張損傷頸動脈可明顯上調c-myc mRNA表達。與假手術組比較，模型組的c-myc mRNA表達為前者的近21倍(P＜0.01)。Rg14 mg/kg還不能降低損傷所致血管壁c-myc基因的過度表達，當其劑量為16 mg/kg則能明顯下調由球囊損傷所致的c-myc mRNA表達的增高(P＜0.01)，使之恢復到假手術組的9倍 (P＜0.01)(見圖2)。

圖1 Rg 1對大鼠頸動脈球囊損傷后管腔面積變化的影響(s，n=5～7)

圖2 Rg1對大鼠頸動脈球囊損傷后c-myc mRNA表達的影響(x ± s，n=4)

3 討論

已知Rg1能抑制球囊損傷所致大鼠頸動脈內膜增生［1］，并通過抑制細胞外信號調節(jié)激酶、PI3K/PKB、蛋白激酶C-ζ等信號通路而抑制腫瘤壞死因子-α 所致 VSMC 增殖［2，3］。一般認為，在VSMC增殖過程中，由于信號通路的協(xié)同作用而導致核轉錄因子如c-fos和c-jun的轉錄，最后使cmyc 轉錄的增加［6］，這是 VSMC 增殖所必需［4，5］。因為c-myc作為一種核內蛋白質類原癌基因，在細胞的增殖、分化及凋亡過程中起重要的調控作用［7］，c-myc表達增高與VSMC增殖與遷移密切相關［8］。抑制早期原癌基因c-myc的表達可減緩和抑制內膜病變的形成，有利于再狹窄的防治［7］。

我們的血管腔面積測定結果表明，Rg1可明顯增大球囊損傷后狹窄的血管管腔，從而進一步證實Rg1的抗球囊損傷所致血管內膜增生作用。本研究結果還表明球囊損傷后，血管壁c-myc基因表達顯著增高，而Rg1 16 mg/kg可明顯下調此基因的過度表達，該藥4 mg/kg對c-myc mRNA表達也有抑制的傾向，表明其抗血管狹窄作用至少部分與其抑制c-myc基因表達有關。基于c-myc基因轉錄的增高是信號通路協(xié)同作用的結果［6］，因此，本工作也間接提示，Rg1在整體動物可能與其在離體培養(yǎng)VSMCs實驗一樣，通過抑制上述信號通路起作用。

［1］Ma Z C，Gao Y，Wang Y G，et al.Ginsenoside Rg1 inhibits proliferation of vascular smooth muscle cells stimulated by tumor necrosis factor-α ［J］.Acta Pharmacol Sin，2006，27(8):1000-1006.

［2］Zhang H S，Wang S Q.Ginsenoside Rg1 inhibits tumor necrosis factor-α (TNF-α)-induced human arterial smooth muscle cells(HASMCs)proliferation［J］.J Cell Biochem，2006，98(6):1471-1481.

［3］Gao Y，Deng J，Yang D L，et al.Ginsenoside Rg1 inhibits vascular intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery by down-regulation of extracellular signal-regulated kinase 2［J］.J Ethnopharmacol，2011，138(2):472-478.

［4］Biro S，F(xiàn)u X M，Yu Z X，et al.Inhibitory effects of antisense oligodeoxynucleotides targeting c-myc mRNA on smooth muscle cell prolifration and migration［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(2):654-658.

［5］Bennett M R，Evan G I，Newby A C.Deregulated expression of the c-myc oncogene abolishes inhibition of proliferation of rat vascular smooth muscle cells by serum reduction，interferon-gamma，heparin，and cyclic nucleotide analogues and induces apoptosis［J］.Circ Res，1994，74(3):525-536.

［6］Jeremy J Y，Rowe D，Emsley A M，et al.Nitric oxide and the proliferation of vascular smooth muscle cells［J］.Cardiovasc Res，1999，43(3):580-594.

［7］蔣偉，黃佩民，王書梅，等.DIM對兔血管損傷后平滑肌細胞c-myc表達的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2011，19(7):570-572.

［8］Hilker M，Tellm ann G，BuerkeM，et al.Expression of the proto-oncogene c-myc in human stenotic aortocoronary bypass grafts［J］.Pathol Res Pract，2001，197(12):811-816.