人VEGF基因腺病毒表達載體修飾大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞①

劉艷枚，劉小慧，方 寧，劉金偉，章 濤

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院暨貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563000)

干細胞臨床轉化應用寄托了各種難治性組織損傷疾病治療的新希望［1，2］。除了干細胞直接移植應用外，將干細胞作為基因治療的載體，由此形成基因與干細胞的聯(lián)合也是重要的新的研究關注點［3］。這一治療新策略成功的前提是選擇易于病毒載體轉染的干細胞類型，并將病毒轉染干細胞帶來的可能傷害降至最低。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived－mesenchymal stem cells，BMMSCs)是最具應用前景的成體干細胞來源，在肢體缺血性疾病等的治療應用研究中已取得了理想的結果［4］。最近，已有采用基因修飾BM-MSCs的治療實驗研究報道，初步證實了采用BM-MSCs攜帶外源基因治療的可行性［5］。本研究選擇具有促進血管新生的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，用腺病毒介導VEGF基因轉染大鼠BM-MSCs，通過轉染報告基因表達、轉染效率和細胞活性檢測等評價該策略的可行性，為VEGF基因修飾大鼠BM-MSCs移植治療糖尿病下肢缺血等慢性缺血性疾病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞株 含人VEGF165基因腺病毒表達載體Ad-VEGF165與空載體Ad-GFP均由蘇州大學楊吉成教授惠贈;HEK293細胞株為本實驗室存留。

1.2 主要試劑與儀器 FITC anti-rat CD29、PE anti-rat CD90和PE anti-rat CD45購自BioLegend公司;LG-DMEM培養(yǎng)基、HG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)為Gibco公司產(chǎn)品;堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購自 Sigma公司。主要儀器:FACS Calibur流式細胞儀(Becton Dickinson);Leica Mirb倒置熒光顯微鏡 (Nikon);Vi-CELLTM XR細胞計數(shù)儀(Beckman Coulter)。

1.3 實驗動物 實驗用SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院實驗動物中心，動物實驗符合有關倫理要求。

1.4 大鼠BM-MSCs的分離培養(yǎng)與免疫表型分析 頸椎脫臼法處死2～3周齡SD大鼠，無菌條件下切取雙側完整股骨，剪開其兩端，用D-PBS沖洗骨髓腔并收集沖洗液，1500 rpm離心5 min，棄上清，用含 10%FBS和 10 ng/ml的 bFGF的 LGDMEM培養(yǎng)液重懸細胞，接種于Corning T25一次性塑料培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)48 h首次換液，去除懸浮生長細胞。當貼壁細胞生長匯合度達80% ～90%時(通常為原代培養(yǎng)5～6 d)，采用0.125%胰蛋白酶消化，按5×105個/ml細胞密度進行傳代培養(yǎng)。取第3代BM-MSCs進行表型標志物CD45、CD29和CD90流式細胞儀分析。

1.5 攜帶人VEGF基因腺病毒表達載體的擴增與效價分析

1.5.1 Ad-VEGF165擴增 采用含 10%FBS的HG-DMEM和T25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)HEK293細胞，待細胞生長匯合度達50% ～80%時，從-20℃冰箱中取出Ad-VEGF165，放入37℃水浴箱中孵育15 min，取100 μl病毒液加入到1個棄培養(yǎng)基的HEK293細胞培養(yǎng)瓶中，作用1 h后，加入3 ml含2%FBS的HG-DMEM培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。病毒轉染48 h后，顯微鏡下觀察細胞成葡萄狀聚集時即可收集細胞，1 000 rpm離心5 min，留少許培養(yǎng)液的細胞沉淀置－80℃冰箱和37℃水浴箱反復凍融3次，使病毒從細胞中充分釋放，再將凍融液2000 rpm離心5 min，收集含病毒的上清液(約0.5 ml)，置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 Ad-VEGF165效價檢測 采用96孔板，每孔接種100 μl密度為1×105/ml的HEK293細胞，培養(yǎng)24 h后，將上述步驟擴增收獲的Ad-VEGF按10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8稀釋后，每孔加10 μl病毒稀釋液，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18 h，置熒光顯微鏡下進行熒光細胞計數(shù)，按下述公式計算制備的病毒原液的病毒效價:病毒效價(pfu/ml)=(平均熒光數(shù)×10)/相應稀釋度。選擇病毒效價≥108以上者用于后續(xù)干細胞轉染實驗。

1.6 Ad-VEGF165體外轉染BM-MSCs 取第3代BM-MSCs，用6孔板，每孔接種1×105個細胞，于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。待細胞生長匯合度達50%～80%時，棄培養(yǎng)基，取上述步驟擴增的重組腺病毒，以感染復數(shù)(MOI)為 20、50、100、200 的Ad-VEGF轉染BM-MSCs，并加含2%FBS和10 ng/ml bFGF的 LG-DMEM 培養(yǎng)基400 μl，輕輕晃動培養(yǎng)板，使病毒混懸液均勻平鋪于細胞上，1 h后再補加1.6 ml相同培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h及48 h后進行流式細胞儀分析轉染效率，結合臺盼藍染色細胞活力觀察，以確定理論的MOI值。注:轉染復數(shù)(MOI)為病毒數(shù)與待轉染細胞數(shù)之比值，也等于病毒效價×病毒液體積/待轉染細胞數(shù)，可理解為轉染一個細胞需要多少病毒數(shù)，理想的MOI值的確定應當是在轉染效率與細胞毒性之間求的平衡。

2 結果

2.1 大鼠BM-MSCs生長特點與免疫表型分析原代培養(yǎng)第5天的細胞可形成大小不等的細胞集落，細胞呈梭形、多角形及不規(guī)則形態(tài)(見圖1A)。傳代48 h后細胞形成漩渦狀排列，呈典型的間充質(zhì)干細胞形態(tài)特征(見圖1B)。對第3代細胞進行流式細胞儀免疫表型鑒定結果表明，分離純化的大鼠BM-MSCs高表達 CD90和CD29，不表達 CD45(見圖1C)。

2.2 Ad-VEGF165的擴增及效價分析 轉染Ad-VEGF165的HEK293細胞光鏡出現(xiàn)細胞圓縮，細胞間隙變大的細胞損傷表現(xiàn);熒光顯微鏡下可見GFP的表達強度隨培養(yǎng)時間延長而增強(見圖2)。收集擴增的 Ad-VEGF165病毒液，從10－1到10－8按10倍梯度稀釋后轉染HEK293細胞，轉染18 h后熒光顯微鏡下可見GFP充滿整個細胞輪廓，且GFP陽性表達細胞數(shù)(熒光數(shù))隨稀釋倍數(shù)遞增而逐漸減少。計數(shù)所有孔中的熒光數(shù)，病毒稀釋度為10－7的孔板中熒光總數(shù)平均值為8(熒光數(shù)值為1～10)，根據(jù)病毒效價(pfu/ml)=(平均熒光數(shù)×10)/相應稀釋度，計算擴增制備的Ad-VEGF165病毒效價為8×108pfu/ml。

2.3 不同感染復數(shù)(MOI)Ad-VEGF165轉染大鼠BM-MSCs的效果 轉染Ad-VEGF165后的BMMSCs仍可貼壁生長，并呈梭形或多角形，但細胞分裂增殖速度減緩。轉染24 h后可見細胞有GFP表達，但強度較弱;之后熒光漸增，并出現(xiàn)病毒毒性反應，如細胞變圓或死亡等;96 h熒光強度最強，隨后逐漸減弱，但病毒毒性漸強，細胞變圓或死亡增多(見圖3)。臺盼藍染色結果表明(見圖4A)，感染復數(shù)(MOI)為20和50組，Ad-VEGF對 BM-MSCs生長與Ad-GFP組和PBS組比較無明顯差異，細胞活性無明顯降低(P＞0.05);MOI為100、200組，Ad-VEGF對BM-MSCs有明顯的生長抑制作用，程度與Ad-GFP組比較無明顯差異，但是與PBS組比較差異明顯，細胞活性明顯降低(P＜0.05)。流式細胞儀檢測結果表明，MOI為50的Ad-VEGF轉染BM-MSCs效率最高，達53.15%(見圖4B)。

圖1 大鼠BM-MSCs生長特點與免疫表型特征

圖2 重組腺病毒轉染HEK293細胞24 h的顯微鏡所見(×100)

3 討論

盡管基因治療概念的提出已有20余年，但目前為止，全球范圍內(nèi)經(jīng)FDA批準的基因治療策略和藥物仍寥寥無幾，原因在于合適的載體選擇、組織特異性定向轉染表達困難以及應用安全性的擔憂。雖然存在上述種種障礙，但科學界一直未放棄基因治療的夢想。近年來，隨著干細胞研究的不斷拓展，已有將基因治療與干細胞移植聯(lián)合應用的研究報道，初步證實了基因修飾干細胞移植這一新治療策略的可行性［6，7］。由于病毒與生俱來的感染性和對宿主細胞的毒性作用特點，是否可將病毒載體轉染目的基因到BM-MSCs，以實現(xiàn)干細胞與基因治療的完美結合，值得深入研究。本文就體外VEGF基因腺病毒表達載體轉染BM-MSCs，并著重于對細胞的毒性作用、轉染效率、最佳病毒劑量等進行研究，是探索這一新策略的前導性工作的有益探索。

重組腺病毒體外能高效、穩(wěn)定的轉染增殖和非增殖狀態(tài)的干細胞，但是病毒效價低于1×108pfu/ml時轉染效率低，即使增加病毒液體積，轉染效率提高也不明顯，且病毒毒性反應加重［8，9］，我們在實驗中也觀察到類似現(xiàn)象。本實驗采用文獻［10］報道的病毒效價計算方法，獲得擴增的Ad-VEGF病毒效價為8×108pfu/ml，高于1×108pfu/ml，說明經(jīng)過本文擴增體系獲得的病毒液可用于后續(xù)的干細胞轉染實驗。本研究還通過臺盼藍染色法檢測不同濃度Ad-VEGF轉染BM-MSCs對其細胞活性的影響，并就Ad-VEGF轉染BM-MSCs的轉染率進行分析，以探尋合理的病毒轉染濃度值(也即理想的感染復數(shù)值)。實驗結果表明，當Ad-VEGF感染復數(shù)(MOI)大于50，BM-MSCs接觸到的Ad-VEGF病毒顆粒增多，病毒毒性作用增強，從而使BM-MSCs活性降低，生長受抑制，甚或大量細胞漂浮、死亡。當加入Ad-VEGF病毒的MOI為50時，Ad-VEGF對BM-MSCs的毒性降低，BM-MSCs細胞活性和生長狀態(tài)良好，易于接受外源性基因，轉染效率也達到最高值53%的水平。

采用VEGF基因或含VEGF基因質(zhì)?；蛉毕菪韵俨《局苯幼⑸涞闹委煼椒?，因存在基因表達時間短，局部水腫明顯等問題，現(xiàn)已很少采用［11］。本實驗采用Ad-VEGF成功轉染BM-MSCs，是將BMMSCs作為腺病毒介導基因治療平臺，不但可以減少進入體內(nèi)的腺病毒劑量以及腺病毒與機體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的直接接觸，有利于減輕腺病毒的毒性反應，同時獲得高水平分泌 VEGF的轉基因 BMMSCs，在各種慢性缺血性疾病的治療中有望達到促進血管新生和組織修復雙重治療效果，具有良好的應用前景。

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