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    響應曲面法優(yōu)化富集桑葉γ-氨基丁酸工藝研究

    2021-12-13 13:43:02靳迎春湯彩云劉冠卉
    關(guān)鍵詞:谷氨酸鈉谷氨酸桑葉

    靳迎春,湯彩云,姚 彤,屠 潔*,劉冠卉,劉 利,3,李 強

    (1.江蘇科技大學 生物技術(shù)學院, 鎮(zhèn)江 212100) (2.江蘇科技大學 糧食學院, 鎮(zhèn)江 212100) (3.中國農(nóng)業(yè)科學院 蠶業(yè)研究所農(nóng)業(yè)部蠶桑遺傳改良重點實驗室, 鎮(zhèn)江 212100)

    γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種廣泛存在于細菌、植物和脊椎動物中的非蛋白質(zhì)氨基酸.動物體中的GABA是由三羧酸循環(huán)谷氨酸脫羧酶( glutamic acid decarboxylase,GAD)催化谷氨酸而成,被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)信號傳導過程中最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有降血壓、鎮(zhèn)靜、減少失眠等功效[1].許多植物體內(nèi)也可通過GAD將谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA,通常植物組織中GABA含量比較低,范圍僅在3.1~20.6 μg/g,但是在鹽、機械損傷、低溫、高溫和低氧等非生物脅迫下,能夠顯著提高GABA含量,從而參與植物代謝,調(diào)節(jié)生命活動[2-3].溶液浸泡法方便易行,是眾多學者研究富集GABA常用的方法,在溶液中添加外源氨基酸,不僅造成了鹽脅迫環(huán)境,還可以形成低氧的逆境,共同作用激活GAD活性,從而使GABA含量增加.文獻[4]利用1%谷氨酸鈉溶液對茶葉浸泡處理10 h,發(fā)現(xiàn)茶葉中GABA含量顯著提升,達到0.624 mg/mL,為對照組的6.8倍.

    桑樹在我國是一種重要的經(jīng)濟作物,為藥食兩用資源,在我國約有四千年的栽培歷史.目前在全國范圍均可見桑樹種植,其中主要集中在華南和西南地區(qū),且在不同的地區(qū)具有典型的種質(zhì)資源[5].桑葉作為蠶桑資源的副產(chǎn)品,含有豐富的營養(yǎng)和活性物質(zhì),具有降血糖、保護心血管、抗氧化、抗炎、提高免疫力等藥理作用[6].研究發(fā)現(xiàn),桑葉中富含GABA,尤其在嫩葉中含量較高,平均含量為0.77 mg/g,顯著高于其他植物中GABA含量[7].文獻[8]對不同品種桑葉GABA含量進行比較發(fā)現(xiàn)華南地區(qū)的典型種植資源育711品種的GABA含量顯著高于其他品種.育711作為中國農(nóng)業(yè)科學院自主選育的優(yōu)質(zhì)桑樹品種,具有高抗性、高發(fā)芽率、高品質(zhì)等優(yōu)點,目前育711主要用于養(yǎng)蠶業(yè),研究多集中在大田栽培表現(xiàn)和調(diào)查經(jīng)濟性狀等方面,而對其桑葉活性成分沒有充分的開發(fā)利用[9].因此,利用育711品種桑葉,挖掘新的富集GABA的生物材料,以開發(fā)富含GABA的功能性食品和保健品,對拓寬我國桑葉資源創(chuàng)新型研究具有一定的現(xiàn)實意義.

    文中以育711品種桑葉為原材料,采用谷氨酸鈉浸泡處理桑葉富集GABA.通過單因素和響應面實驗對影響桑葉GABA含量的浸泡時間、浸泡溫度、谷氨酸鈉濃度等因素進行考察,并獲得富集最佳工藝,為育711的深度開發(fā)提供一定理論依據(jù).

    1 實驗

    1.1 材料與試劑

    桑葉均采自國家桑種質(zhì)資源鎮(zhèn)江桑園圃中3~4月份桑樹(YU711)的2、3葉位.采摘后即刻洗凈備用.

    γ-氨基丁酸購自Sigma公司(美國);谷氨酸鈉(MSG)、十水合四硼酸鈉(Na2B4O7.10H2O)、重蒸酚、次氯酸鈉、無水乙醇,分析純,國藥集團化學試劑有限公司.

    1.2 儀器與設備

    恒溫水浴鍋SY601,天津歐諾有限公司;紫外分光光度計UV-2100,尤尼柯有限公司;酶標儀SpectraMaxi3,美國Molecular Devices公司;電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9140A型,上海三發(fā)科技儀器有限公司.

    1.3 實驗方法

    1.3.1 GABA含量測定

    參照文獻[10]的方法,將桑葉粉浸入100 ℃蒸餾水中(m∶V=1 ∶40),浸泡24 h(40 ℃),每20 min搖動一次.水浴結(jié)束后取出用4層紗布過濾,濾液再經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾后即得桑葉提取液.桑葉GABA含量測定參考文獻[11]的方法,采用比色法測定.

    1.3.2 單因素實驗設計

    分別研究不同谷氨酸鈉濃度(0,3,6,9,12 g/L),不同浸泡溫度(15,20,25,30,35 ℃),不同浸泡時間(5,10,15,20,25 h)這3個因素對桑葉GABA富集效果的影響,每組實驗做3次平行,取平均值.

    1.3.3 響應曲面設計

    根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,選擇最佳的浸泡濃度、浸泡溫度和浸泡時間.采用相關(guān)軟件Design-Expert.V8.0的Box-Behnken設計方法對3個單因素進行優(yōu)化,將優(yōu)化后的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析,得到最佳提取條件,并進行驗證.每組實驗重復 3 次.實驗因素水平及其編碼如表1.

    表1 GABA富集工藝的優(yōu)化實驗因素與水平

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素實驗

    2.1.1 谷氨酸鈉濃度對桑葉GABA富集的影響

    控制浸泡時間為10 h,浸泡溫度為30 ℃,考察浸泡過程中谷氨酸鈉濃度為0~12 g/L時對桑葉GABA含量的影響.從圖1可以看出,隨著谷氨酸鈉濃度的增加,桑葉中GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.當谷氨酸鈉濃度為6 g/L時,桑葉GABA含量達到最高為3.152 mg/g,之后隨著谷氨酸鈉濃度的增加,桑葉GABA的積累量逐漸降低.谷氨酸鈉作為GABA合成的前體物質(zhì),經(jīng)谷氨酸脫羧酶生成GABA,適量的谷氨酸鈉能夠為GAD提供充足的底物促進GABA合成,但是當谷氨酸過度積累時,會對GABA合成通路起反饋抑制作用,降低桑葉中GABA含量.文獻[12]研究也得到類似的結(jié)果,谷氨酸濃度過高時,會抑制GAD活性,導致GABA含量降低.因此富集桑葉GABA實驗中谷氨酸鈉最佳濃度為6 g/L.

    圖1 谷氨酸鈉濃度對桑葉GABA含量的影響

    2.1.2 浸泡溫度對桑葉GABA富集的影響

    控制谷氨酸鈉濃度為3 g/L,浸泡時間為10 h,考察浸泡溫度在15~35 ℃,浸泡時間對桑葉GABA含量的影響.

    圖2 浸泡溫度對桑葉GABA含量的影響

    從圖2可知,桑葉GABA含量隨著浸泡溫度的升高先增加后減少.在15~25 ℃區(qū)間內(nèi),桑葉中GABA含量逐漸增加,達到最高點為2.84 mg/g.在一定的范圍內(nèi),溫度的升高促使細胞Ca2+濃度增加進而加快桑葉中GABA合成酶的反應速率,促使GABA積累[13].但溫度過高會破壞谷氨酸脫羧酶的三級結(jié)構(gòu),從而導致酶活性降低,GABA含量下降[14].研究中,確定溫度25 ℃為桑葉浸泡富集GABA的最佳溫度.

    2.1.3 浸泡時間對桑葉GABA富集的影響

    控制谷氨酸鈉濃度為3 g/L,浸泡溫度為30 ℃,考察浸泡時間在5~25 h時對桑葉GABA含量的影響.從圖3可知,不同的浸泡時間對桑葉中GABA的積累量有顯著的差別,在5~15 h浸泡過程中,桑葉不斷吸收谷氨酸鈉,為GABA支路提供了充足的底物準備,同時在浸泡過程中形成的低氧環(huán)境有利于GAD等酶的激活,因此隨著浸泡時間的延長,GABA含量逐漸上升.當浸泡時間超過15 h后,隨著處理時間的延長桑葉中GABA含量明顯降低.可能的原因是在浸泡過程中,桑葉長期處于低氧條件,丙酮酸和乳酸等代謝產(chǎn)物不斷增加,致使溶液pH值逐漸降低,抑制GAD等酶的催化活性,降低GABA含量.因此,選擇浸泡15 h為桑葉富集GABA的適宜時間.

    圖3 浸泡時間對桑葉GABA含量的影響

    2.2 響應曲面優(yōu)化實驗

    2.2.1 響應曲面實驗結(jié)果

    以浸泡時間(A)、浸泡溫度(B)、谷氨酸鈉濃度(C)為自變量,以桑葉GABA含量為響應值(Y),進行響應曲面分析實驗,結(jié)果如表2.

    表2 響應曲面實驗方案與結(jié)果

    2.2.2 響應面回歸模型的建立與分析

    根據(jù)響應面設計實驗的結(jié)果,得到回歸方程如下:

    Y=4.24-0.34A+0.026B+0.11C+0.061AB-0.035AC+0.13BC-1.27A2-0.3 3B2-0.50C2.

    由表3可知,回歸方程模型P值<0.01,表明該模型是極顯著的,因變量與自變量之間具有顯著的關(guān)系.并且失擬項是不顯著的(P>0.05),擬合度良好,說明該模型選擇正確[15].此模型的相關(guān)系數(shù)為0.975 4,說明該模型與實驗擬合較好,可以用此模型進行預測和分析.因此能用此模型和回歸方程確定富集桑葉GABA的最佳工藝.表3可以看出,模型中二次項均達到顯著水平,而一次項中僅有浸泡時間(A)對桑葉GABA含量影響顯著,其他一次項浸泡溫度(B)、谷氨酸鈉濃度(C)和交互項對桑葉GABA積累影響均不顯著.從各個因素的顯著性差異水平來看,各因素對桑葉GABA積累的影響依次為A(時間)>C(谷氨酸鈉濃度)>B(溫度).

    2.2.3 響應曲面分析

    由回歸方程得出響應曲面和等高線,根據(jù)響應曲面的3D圖形和等高線的形狀分析各因素對桑葉GABA含量的影響.由表3和圖4可以看出,AB和BC的交互作用對桑葉GABA含量的影響較明顯,等高線圖呈現(xiàn)密集的橢圓形,由此也說明AB和BC的之間具有一定的交互作用,這與方差分析結(jié)果相一致.此外,三因素中兩者交互作用圍成的橢圓形的等高線中心存在最小橢圓,則表明響應值(桑葉GABA含量)在3個因子設計的范圍存在最大值[16].

    表3 回歸模型與方差分析

    圖4 三因素的交互作用對桑葉GABA含量影響的等高線和響應面圖

    2.2.4 桑葉GABA最佳富集工藝及結(jié)果驗證

    由軟件Design-Expert 8.0.6預測桑葉GABA含量,得出最佳富集工藝條件為:浸泡時間18 h、浸泡溫度25 ℃、谷氨酸鈉濃度6.22 g/L,得到GABA含量為3.81 mg/g.為檢驗方法的可靠性,按上述優(yōu)化條件進行桑葉GABA富集,實際測得桑葉中GABA含量為3.77 mg/g,與理論值無明顯差異.

    3 討論

    浸泡促使植物組織中GABA含量的增加可能有兩種原因:一方面植物在脅迫環(huán)境下,細胞質(zhì)Ca2+濃度增加,進而影響GAD活性[3].有研究結(jié)果表明,增加Ca2+濃度能夠刺激谷物中GAD的活性,從而促進GABA合成[17].另一方面是浸泡處理提供了缺氧環(huán)境.植物為了抵抗不良環(huán)境脅迫,多胺物質(zhì)含量會增加,提高二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)活性[18].文獻[19]研究發(fā)現(xiàn),鮮茶葉在缺氧條件下,腐胺和精胺含量得到顯著提升,與GAD和DAO活性的升高趨勢基本一致.實驗采用谷氨酸鈉浸泡法富集桑葉中GABA,其含量為普通桑葉的6.28倍,得到了顯著提升,這與文獻[4]在茶葉中富集GABA含量所達到的效果類似,但其具體累積機制尚未見文獻報道,有待進一步研究.桑葉是藥食兩用植物資源,具有降血糖功能[20],桑葉茶、桑葉粉等各種桑葉食品及原料越來越受到消費者的青睞.富集了GABA的桑葉可具有降血壓、改善睡眠等多種功能[10,21],為桑葉食品的開發(fā)提供實驗依據(jù).

    4 結(jié)論

    實驗探討了不同浸泡條件對桑葉GABA積累量的影響,通過單因素和響應曲面分析建立了浸泡法富集桑葉GABA模型,并得到最佳富集工藝,即浸泡時間18 h、浸泡溫度25 ℃、谷氨酸鈉濃度6.22 g/L,該條件下桑葉GABA含量為3.77 mg/g,為未處理桑葉中GABA含量(0.60 mg/g)的6.28倍,顯著提高了GABA含量.在浸泡過程中,浸泡時間對桑葉 GABA含量影響最大.

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