珠子肝泰對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷的影響

張 穎 劉曉麗

（1 鐵嶺衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，遼寧 鐵嶺 112008；2 鐵嶺市中心醫(yī)院，遼寧 鐵嶺 112000）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：珠子肝泰，批號(hào)11050614，由昆明制藥股份有限公司提供，取膠囊內(nèi)容物（每g含原生藥4.03g），加蒸餾水配成所需濃度的藥液。四氯化碳（CCl4），批號(hào)1007162，廣東汕頭市西隴化工廠。加蒸餾水碾勻溶解配成所需濃度的藥液備用。酶譜測(cè)定：ALT，AST，ALP（南京建成生物工程研究所）；MAO（北京鼎國(guó)生物工程公司提供的試劑盒）測(cè)定。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理：計(jì)量資料均以（±s）表示進(jìn)行兩兩均數(shù)的比較，使用SPSS13.0分析統(tǒng)計(jì)。

1.1.2 動(dòng)物：Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量150～230g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（除外正常對(duì)照組） 均飼以高脂大鼠飼料（10%豬油+79%玉米粉+1%膽固醇），以上材料由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。飲水為清水。喂養(yǎng)4周后，給所有大鼠（除外正常對(duì)照組），皮下注射40% CCl4-橄欖油溶液1mL/kg，后每4日注射1次。2個(gè)月后，隨機(jī)將大鼠分為6組，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組（肌苷片）、珠子肝泰低、中、高劑量組，每組10只。正常組大鼠飼以正常飲食；模型：對(duì)照組予以灌胃蒸餾水10mL/kg，1次/日；陽性對(duì)照組予以灌胃肌苷片10mg/kg，1次/日；治療組低劑量組灌胃珠子肝泰供試液5mL/kg，1次/日；治療組中劑量組灌胃珠子肝泰供試液10mL/kg，1次/日；治療組高劑量組灌胃珠子肝泰供試液20mL/kg，1次/日。各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組（正常組除外）給藥期間，繼續(xù)每隔3日注射1次四氯化碳（CCl4）。

1.2.2 檢驗(yàn)方法：給藥2個(gè)月后，到期眼眶靜脈叢取血，分離血清進(jìn)行肝臟功能檢查，測(cè)定ALT、AST、CHE及A/G，將大鼠處死后剖取肝臟稱重，計(jì)算肝臟的重量指數(shù)。大鼠肝臟切片進(jìn)行肝臟組織膠原纖維定量檢查：從大鼠肝臟固定部位取肝組織標(biāo)本，浸泡于10%甲醛溶液固定2h后，逐級(jí)遞度酒精脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色后，光鏡下觀察。另外常規(guī)切片一份，采用Masson染色法做肝Masson染色。將所有各檢大鼠肝Masson染色切片在Mias22000型圖形圖像分析儀進(jìn)行膠原纖維定量分析（測(cè)量肝組織Masson染色切片上5個(gè)視野肝膠原纖維的含量）。剩余大鼠肝組織制成勻漿，測(cè)定CHE，MAO等酶學(xué)指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 病理組織學(xué)檢查

光鏡觀察組織形態(tài)。

2.1.1 HE染色觀察：鏡下見以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞向四周呈放射狀排列且吻合成網(wǎng)，肝血竇亦吻合成網(wǎng)，可見結(jié)締組織及肝小葉構(gòu)成的匯管區(qū)，肝細(xì)胞呈多邊形，較大，胞質(zhì)嗜酸。模型對(duì)照組大鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞，并有較明顯的纖維形成，肝細(xì)胞明顯腫脹變性，肝索排列紊亂，脂肪變多見。中央靜脈周圍可見肝細(xì)胞少量壞死，伴有單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。匯管區(qū)結(jié)締組織增生變寬。各藥物治療組與模型對(duì)照組比較，肝組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞，肝細(xì)胞脂肪變性不明顯。珠子肝泰大劑量組肝組織破壞程度顯著減輕，肝細(xì)胞壞死減少，無明顯匯管區(qū)結(jié)締組織增生。小劑量組程度輕微減輕，肝細(xì)胞壞死減輕，匯管區(qū)結(jié)締組織增生。

2.1.2 膠原纖維染色觀察：模型對(duì)照組大鼠肝臟內(nèi)膠原纖維大量增生，積聚形成間隔和條索，自匯管區(qū)向肝小葉內(nèi)延伸，形成多個(gè)假小葉。各藥物治療組膠原纖維輕度增生，未見假小葉形成，肝正常結(jié)構(gòu)破壞較輕微。

2.2 肝損傷酶活性變化：珠子肝泰能顯著性降低血清ALT酶，升高血清和肝勻漿CHE，顯著性高于模型組（P＜0.01），ALT、AST、ALP、MAO活性均較模型組明顯降低（P＜0.01），見表1。

2.3 對(duì)四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠ALP與自由基的影響：四氯化碳并不導(dǎo)致膽汁瘀積，在ALT升高時(shí)ALP并不急劇升高，但GSH與MAO顯著升高，珠子肝泰大劑量組ALP值與正常組相似，對(duì)ALP卻有明顯降低作用（P＜0.01），對(duì)MAO有顯著清除作用（表2）。

表1 珠子肝泰合劑對(duì)四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠肝功能和肝臟重量指數(shù)的影響（±s）

表1 珠子肝泰合劑對(duì)四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠肝功能和肝臟重量指數(shù)的影響（±s）

注：與肝損傷模型組比較▲P＜0.05，★P＜0.01

組別 劑量 ALT AST TP ALB A/G 肝臟指數(shù)[g/(kg·d)](u/L) (u/L) (g/L) (g/L) (g/100g體質(zhì)量)正常對(duì)照 34.11±3.21 110.72±17.09 84.89±8.16 43.88±2.89 1.74±0.18★ 3.528±0.343模型對(duì)照 66.48±17.30 156.11±13.27 97.93±2.66 45.50±2.72 0.92±0.25▲ 4.190±0.403珠子肝泰 15 42.95±17.44▲ 125.69±21.90 90.57±4.13 45.33±3.41 1.39±0.41 3.284±0.545▲珠子肝泰 10 44.14±15.18▲ 133.37±14.16▲ 90.88±5.40▲ 45.29±3.79 1.07±0.27 3.465±0.343珠子肝泰 5 50.96±10.69▲ 156.70±13.71▲ 95.53±7.17▲ 45.27±3.10▲ 1.27±0.27 4.176±0.685★肌苷片 1.0 47.39±7.39★ 158.35±13.15★ 96.07±6.12★ 45.93±3.88★ 1.31±0.27▲ 3.705±0.814

表2 珠子肝泰合劑對(duì)四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠自由基的影響影響（±s）

表2 珠子肝泰合劑對(duì)四氯化碳所致慢性肝損傷大鼠自由基的影響影響（±s）

注：與肝損傷模型組比較▲P＜0.05，★P＜0.01

組別 劑量 CHE MAO GSH[g/(kg·d)](u/L) (nmol/L) (mg/L)正常對(duì)照 181.2±41.0 122.5±29.1 66.0±13.9模型對(duì)照 262.6±26.2 156.9±23.4 90.0±23.1珠子肝泰 15 303.9±63.6▲ 120.2±19.9 70.0±13.5珠子肝泰 10 292.2±58.9▲ 123.6±14.7▲ 80.0±9.3珠子肝泰 5 281.6±51.5▲ 129.4±15.5▲ 90.0±10.2肌苷片 1.0 275.9±43.6★ 112.5±17.6★ 60.0±11.4

3 討 論

臨床實(shí)踐證實(shí)，乙型肝炎進(jìn)展為肝硬化等重癥肝病不能單純依靠抗病毒治療來阻斷。研究發(fā)現(xiàn)抗肝纖維化治療對(duì)本病患者的預(yù)后有重要的地位，它對(duì)延緩或阻止慢乙型肝炎向肝硬化等重癥肝病發(fā)展起著不可替代的作用[1]。

四氯化碳（CCl4）是一種經(jīng)典的肝臟毒物，它往往通過復(fù)合因素造成大鼠肝損傷及肝硬化模型，是由營(yíng)養(yǎng)不良和化學(xué)中毒造成的肝細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥、壞死、網(wǎng)狀支架塌陷，膠原纖維結(jié)締組織增生，進(jìn)而發(fā)展為肝硬變[2]。四氯化碳致慢性肝損傷的主要機(jī)制是產(chǎn)生三氯甲基自由基，引起肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化以及直接的膜溶解作用，促使肝細(xì)胞壞死，最終肝功能衰竭。攝入大量高脂低蛋白膳食，對(duì)慢性肝損傷的形成及惡化起了輔助作用[3]。

珠子肝泰是一種純中藥制劑，是以苦味葉下珠的主要成分并輔以青葉膽、黃芪和甘草制成的復(fù)方制劑。具有明顯的抗HBV作用且對(duì)肝損傷有一定的防護(hù)作用，能提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，改善體液免疫功能，特別是通過提高紅細(xì)胞免疫黏附功能，從而可促進(jìn)HBV的進(jìn)一步清除[4]。

本實(shí)驗(yàn)中病理組織學(xué)檢查結(jié)果提示，模型對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞變性、壞死、纖維組織增生明顯著于藥物治療組，藥物治療組大鼠均未出現(xiàn)肝硬化。其中珠子肝泰大劑量組的療效優(yōu)于陽性對(duì)照組及其他各組。專家認(rèn)為，肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶含量約為血中的100倍，因此若肝細(xì)胞有1%壞死，可使血清中酶活力增加1倍；此外肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶濃度約較血清中高1000～5000倍左右，肝細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶也可順濃度梯度差而進(jìn)入血液中，因此血清轉(zhuǎn)氨酶（ALT、AST）測(cè)定是判斷肝細(xì)胞損害的敏感指標(biāo)，在一定程度上，血清轉(zhuǎn)氨酶升高反映了肝細(xì)胞的損害程度。ALP的活性主要反映了膽汁淤積[5]。在膠原纖維形成過程中，MAO參與膠原成熟最后階段的架橋形成，因而MAO活性與肝纖維化程度有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)以ALT、AST、ALP、MAO 4種酶聯(lián)合檢測(cè)，反映肝臟各方面的病理變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組酶活性均較各治療組顯著升高。結(jié)果與病理組織學(xué)結(jié)果相一致。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析認(rèn)為珠子肝泰對(duì)CCl4所致大鼠慢性肝損傷有保護(hù)作用。具體原因可能是通過改善肝臟微循環(huán)，抗肝纖維化，改善肝臟病理，抗脂質(zhì)過氧化，繼而取得抗慢性肝損傷的效果。能有效地降低CCl4所致慢性肝損傷大鼠血清與肝勻漿ALT，升高血清和肝勻漿中CHE，說明受損的肝細(xì)胞得以恢復(fù)，GSH是GSH-PX與GSH-ST的底物，并受GGT的調(diào)節(jié)[7-9]。張明娟等的研究也證實(shí)，珠子肝泰對(duì)HBeAg有滅活作用，能抑制細(xì)胞分泌HBcAg，HBeAg，對(duì)急性肝損傷有顯著的保護(hù)作用，并能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有調(diào)節(jié)免疫、保肝和抑制病毒多種作用[10]。當(dāng)肝功能衰竭時(shí)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）與谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GSH-ST）的合成降低，GSH蓄積肝內(nèi)解毒功能下降，珠子肝泰合劑使肝勻漿中GSH水平顯著下降，MAO減少，提示珠子肝泰使肝細(xì)胞得以保護(hù)和修復(fù)，間質(zhì)細(xì)胞的解毒與清除功能加強(qiáng)，組織形態(tài)學(xué)表明肝細(xì)胞受損的程度低于模型組，肝組織修復(fù)增強(qiáng)，珠子肝泰這種作用可能是抑制氧自由基對(duì)細(xì)胞胞膜的損傷有關(guān)。CCl4可導(dǎo)致膽汁瘀積，珠子肝泰有消除瘀膽作用，組織病理學(xué)顯示肝組織內(nèi)未見膽汁瘀積。珠子肝泰對(duì)四氯化碳所致高血清ALT有顯著的抑制作用，血清與肝勻漿CHE值明顯上升，MDA降低，但肌苷片對(duì)四氯化碳損傷的肝細(xì)胞內(nèi)GSH蓄積仍未清除，提示GSH-PX合成受阻，說明前者的恢復(fù)還只是部分恢復(fù)。珠子肝泰組織形態(tài)學(xué)特征與生化結(jié)果有一致性，提示珠子肝泰對(duì)四氯化碳所致慢性肝損傷的作用優(yōu)于肌苷片，珠子肝泰對(duì)四氯化碳的作用可能與抑制炎細(xì)胞浸潤(rùn)，加強(qiáng)肝細(xì)胞器修復(fù)有關(guān)。珠子肝泰對(duì)免疫性肝損傷小鼠ALT與AST有顯著降低作用，微粒體內(nèi)NO水平升高，另外，本實(shí)驗(yàn)中病理組織學(xué)結(jié)果表明，珠子肝泰的療效優(yōu)于肌苷片，且服用方便、起效快，未發(fā)現(xiàn)毒副作用，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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