中國新疆紫花苜蓿復(fù)合體3個(gè)種的遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究

李飛飛，崔大方，羊海軍，鄧超宏，李慶艷

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，廣東 廣州510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 廣州510642）

苜蓿屬（Medicago）植物是豆科（Leguminosae）一個(gè)重要的類群，大多數(shù)苜蓿屬物種都是廣泛分布在溫帶草原上的優(yōu)質(zhì)牧草。而紫花苜蓿（M.sativa）、黃花苜蓿（M.falcata）以及多變苜蓿（M.varia）更是畜牧業(yè)主要的飼料來源［1－3］。

紫花苜蓿復(fù)合體包括9個(gè)可以自然雜交的分類群［4］，包含有二倍體和四倍體物種。在我國僅分布有3個(gè)種，即紫花苜蓿、黃花苜蓿和多變苜蓿。3個(gè)種均為苜蓿屬多年生草本植物，紫花苜蓿花冠各色，淡黃，深藍(lán)或暗紫色、莢果螺旋2～4圈、中央無孔或近無孔，在全國各地都有栽培或呈半野生狀態(tài)；黃花苜蓿花冠黃色、莢果鐮形，分布于我國東北、華北和西北地區(qū)以及中亞及歐洲地區(qū)；多變苜蓿是紫花苜蓿與黃花苜蓿自然雜交產(chǎn)生的類型，其花冠淺紫色、黃色或其他、莢果螺旋0.5～2.0圈、中央有孔，在我國新疆和高加索、中亞細(xì)亞、西伯利亞一帶多有分布［5］。

由于這3個(gè)種形態(tài)相似，并且長期以來在不同的地理?xiàng)l件下雜交，子代和親本類型多樣，使其分類問題存在很大爭議。前蘇聯(lián)學(xué)者在20世紀(jì)初到50年代把它們分成許多種，而中國、美國、加拿大學(xué)者則支持將它們定為一個(gè)種即多變苜蓿。在Small和Jomphe［6］系統(tǒng)中將多變苜蓿以及Lesins和Lesins［7］系統(tǒng)中的紫花苜蓿、黃花苜蓿劃分為紫花苜蓿種下的3個(gè)亞種，分別是M.sativasubsp.varia、M.sativasubsp.sativa及M.sativasubsp.falcata。我國學(xué)者何詠松和吳仁潤［8］通過形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和遺傳現(xiàn)象的觀察認(rèn)為紫花苜蓿和黃花苜蓿屬同1個(gè)種的2個(gè)亞種或生物型或生態(tài)型。李擁軍和蘇加楷［9，10］采用種子貯藏蛋白技術(shù)及RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性，random amplified polymorphic DNA）標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)新疆大葉苜蓿、新牧1號(hào)多變苜蓿和新疆黃花苜蓿之間的遺傳距離為0，支持將這3個(gè)苜蓿類型劃分為紫花苜蓿的3個(gè)亞種。而王俊杰［11］認(rèn)為莢果形態(tài)在苜蓿屬植物“種”及以上分類地位的界定上是十分有效的，而在種下分類單位的界定上則難以發(fā)揮作用，因此不支持Small和Jomphe［6］系統(tǒng)中的劃分，并且將中國黃花苜蓿野生種群的莢果劃分為13個(gè)類型。因此，紫花苜蓿、黃花苜蓿及多變苜蓿這3個(gè)種及其種下類型的分類地位需進(jìn)一步研究確定。

近十余年來，許多分子標(biāo)記包括簡單串聯(lián)重復(fù)序列SSR（簡單重復(fù)序列，simple sequence repeats）［12－14］，RAPD［15，16］，RFLP（限制性片段長度多態(tài)性，restriction fragment length polymorphism）［17］以及細(xì)胞器基因片段［18，19］都曾對苜蓿屬植物進(jìn)行過研究。但這些研究中絕大部分以栽培的紫花苜蓿為主要研究材料，對野生分布的多變苜蓿及黃花苜蓿研究較少，而將共顯性與顯性分子標(biāo)記結(jié)合對廣泛分布于新疆地區(qū)的紫花苜蓿復(fù)合體3個(gè)種的研究還未有報(bào)道。因此本研究利用SSR及ISSR（簡單重復(fù)序列區(qū)間，inter－simple sequence repeat）分子標(biāo)記技術(shù)，比較分析在中國新疆分布的紫花苜蓿、黃花苜蓿和多變苜蓿3個(gè)種共10個(gè)居群的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系，為苜蓿屬植物的分類學(xué)問題以及苜蓿屬植物資源的合理開發(fā)利用和保護(hù)提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及引物

實(shí)驗(yàn)材料于2007－2008年在野外采集，共有3個(gè)種10個(gè)居群，每個(gè)居群選取19份單株，共采集190份單株，記錄編號(hào)后分別放入裝有變色硅膠的封口袋中干燥。居群編號(hào)、采集地及采集地經(jīng)緯度見表1。40對SSR引物來源于Bernadette等［20］發(fā)表的紫花苜蓿SSR引物，37個(gè)ISSR引物來源于UBC大學(xué)公布的100個(gè)通用引物。

表1 樣品采集地信息Table 1 Sample list of location

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于2008年將野外采集的苜蓿屬植物每份單株摘取適量葉片，采用改良CTAB（hexadecyltrimethy－ammonium bromide）法提取植物總DNA，并用1.0%的瓊脂糖電泳檢測DNA的濃度和純度。

SSR反應(yīng)體系：總體積20μL，包括10×Buffer（含 Mg2－）2μL，10mmol／L dNTP 0.3μL，10μmol／L引物各1μL，Taq酶（5U／μL）0.2μL，30ng／μL DNA 模板2μL，去離子水13.5μL。SSR反應(yīng)程序：94℃變性5 min；94℃變性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。ISSR反應(yīng)體系：總體積20μL，包括10×Buffer（含 Mg2－）2μL，10mmol／L dNTP 0.25μL，10μmol／L 引物1μL，Taq酶（5 U／μL）0.2μL，30ng／μL DNA模板2μL，去離子水14.55μL。ISSR反應(yīng)程序：94℃變性5min；94℃變性30s，54℃退火45s，72℃延伸1.5min，42個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；4℃保存。

SSR擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結(jié)果至凝膠成像儀拍照觀察，并記錄結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

由于紫花苜蓿和多變苜蓿為同源四倍體，而黃花苜蓿既含有四倍體又含有二倍體［21］，所以二倍體等位基因的頻率統(tǒng)計(jì)公式并不適合本研究，劉志鵬等［22］曾采用一種將無效等位基因包含在內(nèi)的統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)四倍體，但由于這種方法還未完善，部分統(tǒng)計(jì)指數(shù)還需進(jìn)一步研究。因此本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一采用0／1法統(tǒng)計(jì)，以擴(kuò)增條帶在相對遷移位置有無，賦以“1”或“0”，生成分子數(shù)據(jù)矩陣。利用PopGene 1.32軟件［23］進(jìn)行電泳譜帶差異和各項(xiàng)遺傳指數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，包括：多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）、有效等位基因數(shù)（ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（h）、遺傳分化系數(shù)（Gst）、基因流（Nm）、Shannon信息指數(shù)（I）、遺傳距離（GD）。利用 GeneALEx軟件［24］AMOVA 計(jì)算方差分量，及Mental檢測遺傳距離和地理距離相關(guān)系數(shù)（r）。SSR／ISSR引物多態(tài)信息含量采用計(jì)算公式：

式中，Pi為微衛(wèi)星位點(diǎn)上第i個(gè)等位基因頻率（allelic frequency），Pj為第i＋1個(gè)等位基因頻率。利用POPTREE2［26］軟件采用非加權(quán)平均聚類法（UPGMA）繪制聚類圖，并重復(fù)10 000次計(jì)算自展支持率［27］。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR及ISSR位點(diǎn)多態(tài)性

40對SSR引物中篩選出15對多態(tài)性好、具清晰條帶的SSR引物用于進(jìn)一步研究，在10個(gè)居群190份材料中共獲得66個(gè)位點(diǎn)，64個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，位點(diǎn)數(shù)范圍為2（MTIC258）～11（MTIC248），平均位點(diǎn)數(shù)達(dá)到4.4個(gè)，平均多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)達(dá)4.3個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分比達(dá)到96.97%；10個(gè)ISSR引物共獲得74個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分比達(dá)到100%，位點(diǎn)數(shù)范圍為2（891）～13（822），平均多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)達(dá)7.4個(gè)（表2）。

表2 15對SSR引物及10個(gè)ISSR引物在總?cè)后w中的遺傳多樣性信息Table 2 Genetic diversity informations of 15pairs of SSR primers and 10ISSR primers in total group

多態(tài)信息含量是衡量微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性高低的較好的指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.50時(shí)，具有高度多態(tài)性；當(dāng)0.25＜PIC＜0.50時(shí)，具有中度多態(tài)性；當(dāng)PIC＜0.25時(shí)，具有低度多態(tài)性。SSR標(biāo)記中15個(gè)位點(diǎn)中9個(gè)位點(diǎn)具有高度多態(tài)性，6個(gè)位點(diǎn)具有中度多態(tài)性，其中MTIC248引物PIC值最高（0.84），MTIC258引物PIC值最低（0.34），平均值為0.54。ISSR標(biāo)記中10個(gè)位點(diǎn)中6個(gè)位點(diǎn)具有高度多態(tài)性，4個(gè)位點(diǎn)具有中度多態(tài)性，其中881引物PIC值最高（0.81），891引物最低（0.36），平均值為0.65。

2.2 紫花苜蓿復(fù)合體10個(gè)居群遺傳多樣性分析

SSR標(biāo)記下10個(gè)居群的遺傳變異顯示（表3），不同居群內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)百分率不同，范圍為57.58% （FE）～75.76% （VG），平均值為68.79%，總?cè)后w為96.97%；各居群Shannon信息指數(shù)為0.24（FE）～0.33（VG），平均值為0.30，總?cè)后w為0.35；各居群 Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.16（FE）～0.21（VG），平均值為0.19，10個(gè)群體基本接近，變異幅度不大，總?cè)后w為0.22。10個(gè)居群中多變苜蓿居群VG以上3個(gè)指數(shù)均最高，可見在SSR分子標(biāo)記反映的結(jié)果中多變苜蓿居群VG遺傳多樣性最豐富，黃花苜蓿居群FE的3個(gè)指數(shù)均最低；多變苜蓿5個(gè)居群中3個(gè)指數(shù)最高的為居群VG，最低的為居群VQ，黃花苜蓿4個(gè)居群中3個(gè)指數(shù)最高的為居群FB，最低的為居群FE；多變苜?？?cè)后w多態(tài)位點(diǎn)百分率（92.42%）、Shannon信息指數(shù)（0.35）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（0.22）均大于黃花苜?？?cè)后w指數(shù)（PPB＝86.36%、I＝0.32、h＝0.20）；紫花苜蓿復(fù)合體總?cè)后w基因分化系數(shù)為0.12，基因流為3.62，多變苜蓿居群間基因流 （7.75）大于黃花苜蓿居群間基因流（5.21）。

ISSR標(biāo)記下10個(gè)居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率為47.30% （SH）～75.68% （FH），平均值為66.49%，總?cè)后w為100%；各居群Shannon信息指數(shù)為0.19（SH）～0.30（FH），平均值為0.26，總?cè)后w為0.33；各居群 Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.12（SH）～0.19（FH），平均值為0.17，10個(gè)群體非常接近，總?cè)后w為0.20。與SSR分析結(jié)果不同的是10個(gè)居群中黃花苜蓿居群FH以上3個(gè)指數(shù)均最高，紫花苜蓿3個(gè)指數(shù)均最低；多變苜蓿5個(gè)居群中居群VB以上3個(gè)指數(shù)最高，居群VG最低，黃花苜蓿4個(gè)居群中居群FH以上3個(gè)指數(shù)最高，居群FE最低；多變苜?？?cè)后w多態(tài)位點(diǎn)百分率 （93.24%）大于黃花苜?？?cè)后w（91.89%），但多變苜?？?cè)后wShannon指數(shù)（0.30）和 Nei’s基因多樣性指數(shù) （0.18）略小于黃花苜蓿（I＝0.32，h＝0.20）；總?cè)后w基因分化系數(shù)為0.18，基因流為2.34，基因流低于SSR標(biāo)記的分析結(jié)果，但多變苜蓿居群間基因流（5.43）同樣高于黃花苜蓿（4.94）。黃花苜蓿居群FH在2種分子標(biāo)記下都存在特有位點(diǎn)，但在ISSR標(biāo)記下紫花苜蓿存在1個(gè)特有位點(diǎn)。

表3 紫花苜蓿復(fù)合體10個(gè)居群遺傳變異比較Table 3 Genetic variation of 10populations of M.sativacomplex

2.3 紫花苜蓿復(fù)合體親緣關(guān)系分析

在2種分子標(biāo)記下總?cè)后wShannon指數(shù) （0.35，0.33）以及Nei’s基因多樣性指數(shù) （0.22，0.20）均高于10個(gè)居群的平均值（I＝0.30，h＝0.19；I＝0.26、h＝0.17），可反映出遺傳多樣性主要來源于居群內(nèi)而不是居群間，群體的AMOVA分子方差分析得出SSR標(biāo)記下遺傳變異的7%來源于種間，7%來源于種內(nèi)居群間，86%來源于居群內(nèi)，ISSR標(biāo)記下遺傳變異的12%來源于種間，遺傳變異的10%來源于種內(nèi)居群間，79%來源于居群內(nèi)，2種分子標(biāo)記均證明遺傳變異主要分布在居群內(nèi)。但2種標(biāo)記對種間、居群間、居群內(nèi)差異的劃分并不十分明顯（表4）。

表4 紫花苜蓿復(fù)合體10個(gè)居群SSR變異的分子方差分析Table 4 Analysis of molecular variance（AMOVA）for 190individual plants using 66SSR alleles and 74ISSR bands respectively

SSR標(biāo)記中Nei’s遺傳距離平均值為0.07，ISSR標(biāo)記中Nei’s遺傳距離平均值為0.19。利用Mantel檢測，2種分子標(biāo)記下10個(gè)居群的遺傳距離相關(guān)系數(shù)（r）為0.50，P＜0.001，呈顯著相關(guān)。SSR與ISSR兩種分子標(biāo)記的UPGMA聚類分析表明（圖1）：3個(gè)種中，黃花苜蓿與多變苜蓿關(guān)系較近，紫花苜蓿與其他2種遺傳距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)形成一支，自展支持率為100%；紫花苜蓿的所有居群在2種標(biāo)記下均聚為一類；而黃花苜蓿的FE居群在SSR標(biāo)記下單獨(dú)成為一支，且自展支持率為65%。

圖1 基于SSR（A）及ISSR（B）標(biāo)記下紫花苜蓿復(fù)合體3個(gè)種10個(gè)居群Nei’s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA樹狀圖Fig.1 UPGMA dendrograms of the genetic relationships among 10populations of M.sativacomplex constructed from estimated simple matching genetic distance based on SSR markers（A）and ISSR markers（B）

Sun等［28］認(rèn)為不同標(biāo)記體系的數(shù)據(jù)綜合起來進(jìn)行整體分析，更能客觀的反映種間關(guān)系。因此，本研究將ISSR和SSR數(shù)據(jù)合并起來，計(jì)算紫花苜蓿復(fù)合體10個(gè)居群的遺傳距離，并構(gòu)建UPGMA樹。結(jié)果顯示遺傳距離范圍為0.05（VF和 VB）～0.23（VQ和SH），平均遺傳距離為0.12，大于SSR標(biāo)記下的平均遺傳距離，小于ISSR標(biāo)記下的平均遺傳距離。基于2種分子標(biāo)記構(gòu)建的UPGMA樹（圖2）顯示，多變苜蓿的所有居群聚為一支，自展支持率為86%。在多變苜蓿的5個(gè)居群中進(jìn)一步劃分為2個(gè)亞分支，一支包含VQ、VG和VH居群，另一支包含VF和VB居群。黃花苜蓿的3個(gè)居群聚為一支，自展支持率為79%，F(xiàn)E居群從其他居群中分離出來。Metal相關(guān)性分析證明，多變苜蓿5個(gè)居群和黃花苜蓿4個(gè)居群的遺傳距離與其相應(yīng)的地理距離（表5）不相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.49，P＞0.05；－0.32，P＞0.1。

圖2 基于全部分子數(shù)據(jù)的紫花苜蓿復(fù)合體3個(gè)種10個(gè)居群的Nei’s遺傳距離UPGMA樹狀圖Fig.2 UPGMA dendrogram of the genetic relationships among 10 populations of 3species constructed from estimated simple matching genetic distance based on SSR and ISSR combined data

表5 黃花苜蓿居群間及多變苜蓿居群間的地理距離Table 5 Geographical distances among populations of M.falcataand M.varia km

3 討論

3.1 紫花苜蓿復(fù)合體3個(gè)種及種下居群遺傳多樣性分析

本研究首次以SSR和ISSR標(biāo)記對紫花苜蓿復(fù)合體居群內(nèi)及居群間的遺傳分化模式進(jìn)行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種分子標(biāo)記的平均多態(tài)信息含量都達(dá)到了高度多態(tài)性，且SSR及ISSR位點(diǎn)在居群內(nèi)及居群間均表現(xiàn)為豐富的遺傳變異，表明居群內(nèi)及居群間均存在豐富的遺傳多樣性。此外SSR等位變異與ISSR位點(diǎn)在居群間和居群內(nèi)的變異程度極不平衡，不同位點(diǎn)間的變異相差較大。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記中僅FH具有特有變異位點(diǎn)，ISSR標(biāo)記中僅居群FH和VH具有特有變異位點(diǎn)，這2個(gè)居群的采集地都位于新疆烏魯木齊后峽距白楊溝10km處，因此推測這個(gè)采集地的黃花苜蓿與多變苜蓿具有較豐富的遺傳多樣性，保存價(jià)值大。

在SSR分子標(biāo)記下的群體遺傳多樣性分析表明，黃花苜蓿居群FE的多態(tài)位點(diǎn)百分率、Shannon信息指數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、PIC指數(shù)均最低，并具有最多純合位點(diǎn)，與其他居群差別較大，分析主要有以下2個(gè)原因，1）黃花苜蓿居群FE的樣品形態(tài)特征為葉片小、黃色花、莢果鐮形，且生境偏旱，為黃花苜蓿的變種草原苜蓿（M.falcatavar.romanica）。2）采自額敏喇嘛昭山前荒漠草原，地理分布上處于相對封閉的狀態(tài)，人口牲畜來往不頻繁，不會(huì)帶來太多的雜交機(jī)會(huì)。

10個(gè)居群相比較的結(jié)果表明，SSR標(biāo)記分析中居群VG遺傳多樣性最高，F(xiàn)E遺傳多樣性最低，ISSR標(biāo)記分析中居群FH遺傳多樣性最高，紫花苜蓿遺傳多樣性最低。因此不同的分子標(biāo)記在分析遺傳多樣性時(shí)所得到的結(jié)果有所不同，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)VG位于新疆烏魯木齊甘溝草原站的保護(hù)區(qū)內(nèi)，分布區(qū)內(nèi)的植被得到了當(dāng)?shù)睾芎玫谋Ｗo(hù)，而FH具有特有變異位點(diǎn)，因此這2個(gè)居群在不同分子標(biāo)記中表現(xiàn)出最豐富的遺傳多樣性具有其合理性。而紫花苜蓿在ISSR標(biāo)記中表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性，推測與其為栽培品種有關(guān)。多變苜蓿與黃花苜?？傮w遺傳多樣性相差不大，在2種分子標(biāo)記中高低各有不同，但多變苜蓿多態(tài)性比率在2種分子標(biāo)記中均高于黃花苜蓿，說明多變苜蓿遺傳變異略大于黃花苜蓿。

通過種間－種內(nèi)、居群間－居群內(nèi)各層次結(jié)構(gòu)的AMOVA分析發(fā)現(xiàn)，2種標(biāo)記均顯示群體遺傳變異主要來源于居群內(nèi)。Hilde和Lgor［29］認(rèn)為，一年生或短命多年生、自交和演替階段早期的類群在居群間保持有高的遺傳變異，而壽命長、異交、演替階段晚期的類群在居群內(nèi)保持有高的遺傳變異。而紫花苜蓿復(fù)合體3個(gè)種均為多年生、異交、演替階段晚期植物，因此在居群內(nèi)具有高的遺傳變異與其本身生物學(xué)特性有關(guān)。

多變苜蓿5個(gè)居群之間的基因流（SSR Nm＝7.752，ISSR Nm＝5.431）大于黃花苜蓿4個(gè)居群之間的基因流（SSR Nm＝5.214，ISSR Nm＝4.939）；SSR標(biāo)記中總?cè)后w基因流為3.619，ISSR標(biāo)記分析中總?cè)后w基因流為2.336。本研究結(jié)果中的基因流均大于一般廣布種植物的基因流（Nm＝1.881）［30］，且 Wright［31］認(rèn)為，當(dāng) Nm值大于1時(shí)基因流就可以防止由遺傳漂變引起的居群之間的分化，因此紫花苜蓿復(fù)合體種群中的基因流防止了3個(gè)種居群之間的分化，并防止了同源四倍體在進(jìn)化過程上變得呆板。

雖然基因流對防止物種分化具有很重要的作用，但另一方面，在人類活動(dòng)干擾或自然環(huán)境變化過程中，種間基因流和雜交可能導(dǎo)致原生境隔離的近緣物種間產(chǎn)生雜交沒化（hybridization merging），使得物種間的區(qū)別不再像以前明顯進(jìn)而導(dǎo)致物種合并［32，33］，形成不同分類群間遺傳同化（genetic assimilation）現(xiàn)象。因此介于紫花苜蓿復(fù)合體3個(gè)種之間具有的雜交現(xiàn)象，其種群的基因流會(huì)隨時(shí)間而改變，需定時(shí)對其進(jìn)行測定，以了解當(dāng)前這3個(gè)種的遺傳分化。

3.2 紫花苜蓿復(fù)合體3個(gè)種的親緣關(guān)系分析

從聚類圖上分析，SSR與ISSR數(shù)據(jù)合并構(gòu)成的聚類圖不僅符合2個(gè)標(biāo)記共有的特征，且所反映三者之間的關(guān)系更為客觀。UPGMA樹上形成3個(gè)主要的分支，紫花苜蓿獨(dú)立成一支，來源于同一采集地的黃花苜蓿居群FH與多變苜蓿居群VH都已分開，充分說明多變苜蓿、黃花苜蓿和紫花苜蓿雖然遺傳關(guān)系較近，但三者之間仍可以得到有效地劃分，因此盡管這3個(gè)種之間的遺傳關(guān)系非常近，但本研究仍支持將多變苜蓿、黃花苜蓿和紫花苜蓿劃分為3個(gè)種。很長一段時(shí)間，黃花苜蓿是否應(yīng)當(dāng)劃分為一個(gè)單獨(dú)的種都存在爭議。Brummer等［34］采用RFLP分析二倍體和四倍體苜蓿發(fā)現(xiàn)黃花苜蓿與M.caerulea不同，能有效的區(qū)分。Havananda等［35］基于葉綠體和線粒體基因同樣也討論了黃花苜蓿與M.caerulea的關(guān)系，葉綠體的結(jié)果顯示黃花苜蓿明顯的與較原始的種M.caerulea分別開來，而線粒體的結(jié)果卻不明顯。因四倍體的紫花苜蓿是由M.caerulea直接進(jìn)化而來，故本研究中基于SSR和ISSR兩種分子標(biāo)記分析的結(jié)果與Havananda等［35］的研究結(jié)果相似。而孫毅等［36］利用核基因ITS的研究結(jié)果顯示黃花苜蓿與紫花苜蓿應(yīng)該合并為一個(gè)種。因此，這些研究結(jié)果并不能決定這3個(gè)分類群為種或亞種，但可以確定的是他們的DNA序列很不相同，利用不同的基因片段分析得出的結(jié)果會(huì)不一樣。從地理分布和物種特性上來看，完全野生的紫花苜蓿沒有記載，而黃花苜蓿多為野生分布。因此本研究支持將這3個(gè)分類群作為3個(gè)種的劃分。遺傳關(guān)系顯示多變苜蓿與黃花苜蓿關(guān)系較近，這與李擁軍和蘇加楷［10］利用RAPD分子標(biāo)記所得到的結(jié)果有所不同，他認(rèn)為多變苜蓿與紫花苜蓿遺傳距離更小。

多變苜蓿、黃花苜蓿各居群的遺傳距離與其地理距離相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)沒有顯著相關(guān)性存在于多變苜蓿及黃花苜蓿的遺傳距離與地理距離之間。這主要由于紫花苜蓿各居群的生長環(huán)境不一致導(dǎo)致，而黃花苜蓿居群FE主要為草原苜蓿與其他居群遺傳分化較大，明顯區(qū)分于其他居群分支而單獨(dú)存在。因此本研究的分子標(biāo)記所得到的結(jié)果支持Lesins和Lesins［7］的結(jié)論，即草原苜蓿為黃花苜蓿一個(gè)變種的分類學(xué)地位。

通過以上研究，得出以下3個(gè)結(jié)論：1）多變苜蓿居群VG和黃花苜蓿居群FH在10個(gè)居群中遺傳多樣性最高，并且居群FH及居群SH含有特有多態(tài)性位點(diǎn)，因此需要加強(qiáng)保護(hù)。2）本研究結(jié)果支持仍將紫花苜蓿復(fù)合體3個(gè)分類群劃分為3個(gè)種。3）SSR和ISSR標(biāo)記作為研究紫花苜蓿復(fù)合體的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系是非常有效的分子標(biāo)記。

致謝：感謝牧草植物分類學(xué)專家崔乃然教授的指導(dǎo)，感謝新疆畜牧科學(xué)院李捷老師提供的幫助。

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