人參皂苷抗糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨質(zhì)疏松的效應(yīng)及機制研究

呂 祥杜 娟程彬彬李 柏李 勇凌昌全，3

（1上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海市閘北區(qū)芷江中路274號，200071；2第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院中醫(yī)科；3上海高校內(nèi)科中醫(yī)學E-研究院）

人參皂苷抗糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨質(zhì)疏松的效應(yīng)及機制研究

呂 祥1杜 娟2程彬彬2李 柏2李 勇1凌昌全2，3

（1上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海市閘北區(qū)芷江中路274號，200071；2第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院中醫(yī)科；3上海高校內(nèi)科中醫(yī)學E-研究院）

目的：研究人參皂苷（GSS）對糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學及骨密度的改善作用及其機制。方法：將3月齡的雌性Wister大鼠隨機分為5組，即正常對照組、模型組（激素組）和人參皂苷高、中、低劑量組（激素+用藥組）。皮下注射甲潑尼龍5mg/Kg·d-1，建立骨質(zhì)疏松癥模型。人參皂苷組造模后GSS高（100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg），每日2次，其他2組給予等量生理鹽水，實驗期為9w。9w后測定各組大鼠骨密度（BMD）、骨代謝生化指標及骨生物力學指標等。結(jié)果：反映骨形成指標BGP、CT及血清Ca水平，模型組顯著低于正常組，人參皂苷高劑量組顯著高于模型組（P＜0.05），反映骨吸收的TRACP酶活性及血清P水平，各組之間無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與正常組比較，模型組大鼠腰椎與股骨骨密度、最大載荷及剛度均顯著降低（P＜0.05），且腰椎骨密度下降更為明顯，與模型組比較，人參皂苷高劑量組大鼠腰椎及股骨骨密度、最大載荷及剛度均顯著增高（P＜0.05）。結(jié)論：人參皂苷GSS可通過改善骨代謝生化指標及骨生物力學性能，拮抗糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠的骨丟失，起到防治骨質(zhì)疏松的作用。

糖皮質(zhì)激素；骨質(zhì)疏松；人參皂苷

糖皮質(zhì)激素（Glucocorticiod，GC）被廣泛用于治療多種自身免疫性疾病，但大量的臨床實踐證實，糖皮質(zhì)激素猶如一把雙刃劍，在發(fā)揮治療作用的同時，也會對人體產(chǎn)生巨大的副作用。骨質(zhì)疏松就是應(yīng)用GC的主要并發(fā)癥之一。有研究表明大約90%長期使用GC治療的患者，有明顯的骨量丟失、骨質(zhì)改變，骨折發(fā)生率明顯增加［1］。目前該病的發(fā)病機制尚不明確，防治尚無有效的治療方法。本研究通過檢測骨密度、骨代謝生化指標及骨生物力學性能，探討人參皂苷對糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 人參皂苷（純度＞85%）由上海藥檢所提供，溶解于DMSO備用；甲潑尼龍，500mg/瓶，Pfizer公司，批號：R02069；骨鈣素、降鈣素試劑盒購于上海時代生物科技有限公司；血清抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒購于南京建成生物工程研究所。QDR4500A型雙能X線骨密度測定儀（DEXA，美國麻省HOLO GIC公司生產(chǎn)）；MTS-858型生物力學材料試驗機（美國）。

1.2 實驗動物 3月齡雌性Wister大鼠，50只，體重150g左右，由中國科學院上海實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（滬）2010-0003。

2 方法

2.1 動物造模及分組 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機分為5組：正常對照組10只，模型組（激素組）10只，人參皂苷治療組（激素+用藥組）30只（GSS 100mg/ kg，50mg/kg，25mg/kg）。參考Hulley［2］等的造模方法，模型組采用甲潑尼龍5mg/Kg·d-1皮下注射每周5次；對照組以等量生理鹽水0.75mL/kg皮下注射；用藥組造模后分別給予GSS高（100mg/kg）、中（50mg/ kg）、低（25mg/kg）。每日2次，實驗期9w。所有動物在同條件下飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，每周稱體重1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)節(jié)藥物劑量。

2.2 體質(zhì)量測量及生長情況觀察 實驗期間密切觀察大鼠生活情況（包括攝食、飲水、活動、皮膚色澤等），實驗前、實驗開始后每周用天平測量大鼠體質(zhì)量，觀察其變化。

2.3 骨密度測定 取大鼠第5腰椎（保留椎體和棘突）和右側(cè)股骨分別剔盡其附著軟組織，用浸透生理鹽水紗布包裹，檢測時去掉紗布，將標本置于雙能X線骨密度測定儀上測定，計算機采用小動物梯級標準分析軟件，并自動記錄骨密度。

2.4 骨生物力學測定 1）壓縮實驗：應(yīng)用大鼠第5腰椎，去除棘突，只保留椎體，實驗試件經(jīng)切割打磨去除軟骨板，并使兩面平行，將標本置于鋼制平臺上，保持椎體上下面水平，加載速度為2mm/min，壓縮以過最大載荷為限，計算機得出載荷位移曲線。2）三點彎曲實驗：取右股骨全長，兩端用牙托粉澆鑄固定后放在試驗機上測試，跨距22mm，標本橫截面短軸的方向與加載力方向一致，最大加載速度2mm/min，計算機得出載荷撓度曲線。

2.5 血清學指標檢測 各組大鼠均于末次干預(yù)給藥后禁食12h，用10%水合氯醛1mL/kg麻醉后，腹主動脈采血，血液離心（300r/min，10min）。分離血清，-80℃冰箱凍存待測，分別采用全自動生化分析儀測定血清鈣、磷，放射免疫法測定血清BGP、CT含量，及比色法測定血清TRACP酶活性等指標。

2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)均以（±s）表示，各組之間比較采用單因素方差分析，組間差異用SNK法。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般生長情況 在激素應(yīng)用過程中，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)毛被稀疏缺乏光澤、懶動、少食、體質(zhì)量增長緩慢等，而正常組和人參皂苷高劑量組大鼠活動自由，皮毛光澤。實驗過程中有4只大鼠因感染和灌胃死亡，被剔除。

3.2 血清學指標測定結(jié)果 反映骨形成指標BGP、CT及血清Ca水平，模型組顯著低于正常組，人參皂苷高劑量組顯著高于模型組（P＜0.05）；反映骨吸收的TRACP酶活性及血清P水平，各組之間無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1、表2。

表1 人參皂苷GSS對骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝指標的影響（±s）

表1 人參皂苷GSS對骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝指標的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別例數(shù)BGP（ng/mL）CT（pg/mL）TRACP（U/L）101.48±0.41210.25±31.2518.15±6.52模型組90.87±0.32*168.43±27.58*23.34±6.72人參皂苷高劑量組91.36±0.41△204.52±26.75△19.43±6.26人參皂苷中劑量組91.12±0.38*183.62±27.56*20.52±5.45人參皂苷低劑量組90.90±0.35*169.32±26.53*正常組23.48±5.67

表2 人參皂苷GSS對骨質(zhì)疏松大鼠血清Ca、P水平的影響（±s）

表2 人參皂苷GSS對骨質(zhì)疏松大鼠血清Ca、P水平的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別例數(shù)Ca（mmol/L）P（mmol/L）101.23±0.221.78±0.47模型組90.93±0.15*1.97±0.43人參皂苷高劑量組91.22±0.21△1.87±0.33人參皂苷中劑量組91.08±0.18*1.92±0.28人參皂苷低劑量組90.96±0.15*正常組1.98±0.36

表3 人參皂苷GSS對骨質(zhì)疏松大鼠BMD的影響（g/cm2，（±s）

表3 人參皂苷GSS對骨質(zhì)疏松大鼠BMD的影響（g/cm2，（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別例數(shù)股骨BMD（g/cm2）腰椎BMD（g/cm2）100.258±0.0130.254±0.011模型組90.242±0.011*0.236±0.012*人參皂苷高劑量組90.258±0.004△0.249±0.007△人參皂苷中劑量組90.252±0.008*0.249±0.018*人參皂苷低劑量組90.248±0.015*0.241±0.013正常組*

表4 股骨三點彎曲及第5腰椎壓縮實驗結(jié)果比較（±s）

表4 股骨三點彎曲及第5腰椎壓縮實驗結(jié)果比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別例數(shù)三點彎曲實驗最大載荷（N）三點彎曲實驗剛度（N/mm）壓縮實驗最大載荷（N）壓縮實驗剛度（N/mm）21.65±37.58模型組9123.93±15.46*175.87±35.74*216.85±21.73229.69±79.51人參皂苷高劑量組9145.63±13.92△253.86±54.72△250.84±18.85△315.98±70.82△正常組10147.04±19.78259.32±68.64267.78±14.973人參皂苷中劑量組9132.32±15.63*218.45±27.56*232.33±17.73*267.52±53.45*人參皂苷低劑量組9127.82±18.06*180.32±26.53*223.05±19.49*242.57±43.76*

3.3 骨密度的變化 與正常組比較，模型組大鼠腰椎與股骨骨密度均顯著降低（P＜0.05），且腰椎骨密度下降更為明顯，與模型組比較，人參皂苷高劑量組大鼠腰椎及股骨骨密度均顯著增高（P＜0.05），見表3。

3.4 骨生物力學指標結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠腰椎與股骨最大載荷、剛度均顯著降低（P＜0.05），與模型組比較，人參皂苷高劑量組大鼠腰椎及股骨最大載荷、剛度均顯著增高（P＜0.05），見表4。

4 討論

GC已廣泛用于臨床，而長期使用類固醇激素造成的骨質(zhì)疏松，為繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的首要病因。臨床上這類患者骨代謝主要表現(xiàn)為骨形成的降低和骨吸收的增加。目前治療手段有限。骨密度是診斷骨質(zhì)疏松、評價骨質(zhì)疏松的程度及療效的必要手段，DEXA直接測量實驗動物的BMD，具有較高的精密度和準確度［3］，故本實驗選用骨密度作為評價模型制備成功的指標。Iwamoto等［4］研究發(fā)現(xiàn)GC引起骨量丟失是從松骨開始的，且以松質(zhì)骨含量豐富區(qū)明顯。實驗結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠股骨、腰椎BMD顯著下降，且以腰椎BMD下降更為明顯，表明糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松模型制備成功，且松質(zhì)骨骨密度較皮質(zhì)骨下降更為明顯，與Iwamoto等的研究結(jié)果一致，而臨床上骨質(zhì)疏松骨折也常發(fā)生在腰椎及髖骨等部位。

以往研究表明，糖皮質(zhì)激素可抑制成骨細胞的產(chǎn)生，促使成骨細胞及骨細胞的凋亡，使成骨細胞的數(shù)目減少，功能降低，使骨形成減少；同時，成骨細胞不能正常募集到骨侵蝕表面，使破骨細胞吸收的骨面不能被填補而造成骨丟失［5］。BGP又稱為γ羥基谷氨酸蛋白（Bone Gla Protein），是成骨細胞合成和分泌的一種激素樣多肽，是反映骨更新狀態(tài)和骨形成的一種特異性指標。血清中BGP水平的變化直接反映成骨細胞活性，是成骨細胞功能和骨質(zhì)礦化的特殊標志物，是衡量骨形成的一個重要指標。CT是主要由甲狀腺C細胞合成和分泌的一種激素，對骨代謝有重要的調(diào)節(jié)作用，通過受體介導(dǎo)作用能抑制破骨細胞的活性。實驗結(jié)果表明：骨質(zhì)疏松大鼠血清BGP、CT、Ca含量下降，且均與骨密度結(jié)果相符，表明GC能抑制鈣吸收，抑制成骨細胞活性，影響骨礦物質(zhì)沉淀及骨形成而導(dǎo)致骨丟失；人參皂苷高劑量組大鼠血清BGP、CT、Ca水平顯著高于模型組，表明使用高劑量的人參皂苷后，成骨細胞增生活躍，骨吸收受到抑制，骨量丟失相對減少。提示人參皂苷對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松有治療作用。

骨生物力學是研究骨組織在外力作用下的力學特性及受力后生物學效應(yīng)，是骨量、骨結(jié)構(gòu)及骨質(zhì)量的綜合反映。發(fā)生骨質(zhì)疏松后，骨的力學性能下降，抗外力能力降低，骨脆性增加，致使骨折發(fā)生率提高。故防治骨質(zhì)疏松癥的藥物從生物力學角度應(yīng)能穩(wěn)定骨的生物力學性能，改善骨質(zhì)疏松癥患者骨組織結(jié)構(gòu)力學性能，提高骨的強度和韌性。椎體和股骨的最大載荷和剛度是反映生物力學性質(zhì)的重要指標；最大載荷反映骨的載荷能力，剛度是指在軸向載荷作用下抵抗變形的能力。骨的最大載荷和剛度與BMD呈顯著正相關(guān)［6］，當骨質(zhì)疏松時，骨密度下降，骨的最大載荷和剛度下降，骨折容易發(fā)生。本實驗顯示骨質(zhì)疏松模型大鼠第5腰椎、股骨的最大載荷與剛度相對正常對照組顯著降低，且與BMD變化方向一致，而人參皂苷則能維持糖皮質(zhì)激素大鼠腰椎生物力學性能基本穩(wěn)定，提示人參皂苷對激素性骨質(zhì)疏松大鼠椎骨、股骨生物力學性能變化具有的拮抗作用。

綜上所述，人參皂苷能提高糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨質(zhì)疏松大鼠骨密度，改善骨代謝生化指標及骨生物力學性能，從而起到抗骨質(zhì)疏松作用，但其具體作用環(huán)節(jié)以及機理有待進一步深入研究。

［1］Fujita K，Kasayana S，Hashimato J.Inhsled corticosteroids reduce bone mined density in early postmenopausal but not premenopausal asthmatic woman.J Bone Miner Res，2001，16：782.

［2］Hully P A，Conrad IE M M，Langeveldt C R，et al.Glucocorticoid-induced osteoporosis in the rat isprevented by the tyrosine phosphatase inhibitor，sodium orthovanadate.Bone，2002，31（1）：220-229.

［3］Griffin M G，Kimble R，Hopfer W，et al.Dual-energy x-ray-absorptiometry of the rat：accuracy，precision，and measurement of bone loss.Bone Miner Res，1993，8（7）：7952-8001.

［4］Iwamoto J，Seki A，Takeda T，et al.Effects of alfacalcido oncancelous and cortical bone mass in rats treated with glucocorticoid：a bone histomorphometry study.Nutr Sci V itam inol（Tokyo），2007，53（3）：191-197.

［5］劉亞偉.糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及治療進展.國外醫(yī)學·泌尿系統(tǒng)分冊，2004，24（5）：711-714.

［6］劉文軍，廖進民，譚小云，等.椎體骨密度、體積骨密度與生物力學強度的比較.中國臨床康復(fù)，2004，8（5）：880-881.

（2011-08-15收稿）

悼念國醫(yī)大師何任教授

我社第一屆編委會顧問，中國共產(chǎn)黨優(yōu)秀黨員，國醫(yī)大師，著名中醫(yī)教育家、理論家、臨床家，浙江中醫(yī)藥大學終身教授、博士生導(dǎo)師何任先生，因病醫(yī)治無效，于2012年2月23日離我們而去，享年93歲。何任先生醫(yī)術(shù)精湛、醫(yī)德高尚，為醫(yī)家楷模，令世人敬仰。

Impact and Mechanism of Ginsenoside on anti-glucocorticoid Induced Osteoporosis

Lu Xiang1，Du Juan2，Cheng Binbin2，et al.
（1 Shanghai Hospital of TCM，Add.：No.274，Zhi Jiang Middle Road，Zhabei District，Shanghai，post code：200071；2 TCM department of Changhai Hospital，the 2nd Military Medical University）

Objective：To investigate modifying impact and mechanism of Ginsenoside saponins（GSS）on bone biomechanics and bone density in glucocorticoid induced osteoporosis rats.Methods：Three month aged female Wister rats were randomly divided into 5 groups，namely the normal control group，model group（hormone treated）and ginseng saponin in high，low，group plus hormone treatment. Subcutaneous injection of methylprednisolone（5mg/Kg）to establish the osteoporosis model.Ginseng saponins groups were given GSS at respective dosages，i.e.high（100mg/kg），medium（50 mg/kg），low（25 mg/kg），twice a day.The other two groups weregiven the same amount of normal saline.After 9W，ratsˊbone mineral density（BMD）and biochemical markers of bone metabolism and bone biomechanics were observed.Results：The index of BGP，CT and Ca of the model group were significantly lower than those of the normal group，and of the high dosage GSS group（P＜0.05）.The difference of RACP and serum P were not significant among groups（P＞0.05）；Compared with normal group，the rats in the model group showed reduced lumbar and femoral bone mineral density，maximum load and stiffness（P＜0.05），and a lumbar bone density decreased more significantly.Compared with the model group，those parameters were significantly higher in high dose group of ginsenosides rats（P＜0.05）.Conclusion：Ginsenoside can prevent and treat osteoporosis by improving biochemical markers of bone metabolism and bone biomechanics and antagonizing bone loss in glucocorticoid reduce osteoporosis.

Glucocorticoid；Osteoporosis；Ginsenoside

國家自然科學基金青年項目（NO.81001672）；上海市自然科學基金項目（NO.09ZR1439000）；上海市衛(wèi)生局科教處科研項目（NO.2009179）；上海市高等學校中醫(yī)內(nèi)科學E-研究院建設(shè)計劃（項目編號：E03008）