超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的耐藥性

朱立強(qiáng)

大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)是一種革蘭陰性條件致病菌，正常菌群多分布于人體的呼吸道、消化道和泌尿道，通常在人體免疫力低下時(shí)在這些部位發(fā)展成致病菌而感染致病，是臨床分離的革蘭陰性桿菌中最常見的菌種，它作為重要的條件致病菌廣泛存在于自然界［1］。E.coli已成為醫(yī)院主要感染病原菌，且多重耐藥十分嚴(yán)重［2-5］，它引致的社區(qū)和醫(yī)院內(nèi)獲得性感染，包括肺部感染、消化道感染、泌尿系感染、傷口感染以及敗血癥及腦膜炎等［6］。

大腸埃希菌的耐藥性變得日益嚴(yán)重，了解大腸埃希菌耐藥性的變遷規(guī)律及抗菌藥物使用的變化趨勢(shì)，對(duì)臨床合理選用抗生素，保證療效，減少耐藥菌株的產(chǎn)生具有重要意義［7］。為了解該菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性，我們分析了鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2010年間853株大腸埃希氏菌產(chǎn)ESBLs菌株的發(fā)生率及對(duì)抗菌藥物的耐藥性特性，為臨床合理使用抗生素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 菌株來(lái)源 大腸埃希菌853株來(lái)自鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2010年1月至2011年10月住院和門診患者血液、尿液、痰液、膿液等標(biāo)本。

1.1.2 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC 25922;肺炎克雷伯菌ATCC700603購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.3 抗生素藥敏紙片 諾氟沙星(NOR)、米諾環(huán)素(MNO)、四環(huán)素(TCY)美洛培南(MEM)、呋喃妥因(NIT)、亞胺培南(IPM)、哌拉西林(PIP)、慶大霉素(GEN)、環(huán)丙沙星(CIP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、復(fù)方新諾明(SXT)、阿米卡星(AMK)、頭孢吡肟(FEP)、氨芐西林(AMP)、頭孢呋辛(CXM)均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、中國(guó)蘭培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基、M-H瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)于貝瑞特生物技術(shù)(鄭州)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器 珠海Bact-IST全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀(購(gòu)自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司);上海齊欣HH.CP-01二氧化碳細(xì)菌培養(yǎng)箱(購(gòu)自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司);HF-safe-1200/C生物安全柜(購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)分離 對(duì)所有送檢標(biāo)本按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》［8］接種到培養(yǎng)基中，再將培養(yǎng)基放入上海齊欣 HH.CP-01二氧化碳細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 培養(yǎng)分離后經(jīng)革蘭染色鏡檢，初步鑒定后，按照腸桿菌鑒定及藥敏測(cè)試板說(shuō)明書操作，藥敏測(cè)定步驟:①制備菌懸液:取一支無(wú)菌脫脂棉簽用生化培養(yǎng)液浸濕，或接種環(huán)取適量待檢菌株純培養(yǎng)物置于稀釋液中，旋轉(zhuǎn)棉簽或接種環(huán)研磨，使細(xì)菌離開棉簽或接種環(huán)進(jìn)入培養(yǎng)液中，將細(xì)菌濃度調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬蔀榧?xì)菌懸濁液液。②加樣:將細(xì)菌懸濁液、稀釋液和鑒定板放到加樣器上自動(dòng)加樣。③封板培養(yǎng):將貼紙貼到藥敏板上密封好，置35℃ ～37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中，孵育24 h后，用珠海Bact-IST全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀鑒定確證為大腸埃希菌菌株及其藥敏結(jié)果。藥敏結(jié)果均按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2009年標(biāo)準(zhǔn)判定，以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)報(bào)告結(jié)果。

1.3.3 ESBLs的檢測(cè) ESBL確證試驗(yàn):采用肉湯稀釋法，用頭孢他啶(0.25～128μg/ml)和頭孢他啶/克拉維酸(0.25/4～128/4μg/ml)、頭孢噻肟(0.25 ～64μg/ml)和頭孢噻肟/克拉維酸(0.25/4～64/4μg∕ml)，分別測(cè)試其最低抑菌濃度(MIC)。當(dāng)兩種藥物與加克拉維酸聯(lián)合的藥物MIC減低≥3個(gè)倍比稀釋度，確認(rèn)為產(chǎn) ESBL株。(例如，頭孢他啶MIC=8μg/ml，頭孢他啶/克拉維酸 MIC=1μg/ml)

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌檢出率 2010年和2011年853株E.coli感染的臨床標(biāo)本來(lái)源及檢出率，見表1。兩年共發(fā)現(xiàn)853株E.coli，其中產(chǎn)ESBL菌株477株，故產(chǎn)ESBLs率為55.92%。2010年全年發(fā)現(xiàn)E.coli449株，2011年1月～10月發(fā)現(xiàn)E.coli404株。兩年E.coli均主要來(lái)源于尿標(biāo)本，2010年為295株(65.70%)，2011年為247株(61.14%)。

表1 853株大腸埃希菌標(biāo)本檢出率

2.2 產(chǎn)ESBLs菌株在不同標(biāo)本中的分布 在不同的標(biāo)本中ESBLs菌株的產(chǎn)生有所不同，其結(jié)果顯示為尿標(biāo)本中比率相對(duì)較高，如圖1。2010年220株產(chǎn)ESBL菌株中有117株檢出自尿標(biāo)本(53.18%)，61株自痰標(biāo)本(27.73%)，血標(biāo)本和膿液各有21株(9.55%)。2011年257株產(chǎn)ESBL菌株中有140株檢出自尿標(biāo)本(54.48%)，65株自痰標(biāo)本(25.30%)，血標(biāo)本中檢出23株(8.95%)，膿液檢出21株(11.28%)

圖1 ESBLs菌株在不同標(biāo)本中的分布情況

2.3 產(chǎn)ESBL大腸埃希菌耐藥情況分析 產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌耐藥情況見圖2。兩年大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率沒(méi)有明顯差異，2010年220株和2011年257株產(chǎn)ESBL的大腸埃希菌對(duì)頭孢類藥物、青霉素類藥物和單環(huán)內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率皆為100%，碳?xì)涿瓜╊愃幬飫t全部敏感。

圖2 2010年和2011年產(chǎn)ESBL大腸埃希菌耐藥情況

2.4 2010年產(chǎn)ESBLs株與非產(chǎn)ESBLs株的耐藥性比較

表2 2010年產(chǎn)ESBLs株與非產(chǎn)ESBLs株的耐藥比較

2.5 2011年產(chǎn)ESBLs株與非產(chǎn)ESBLs株的耐藥性比較，見表3。

表3 2011年產(chǎn)ESBLs株與非產(chǎn)ESBLs株的耐藥性比較

3 討論

大腸埃希菌廣泛分布于多種臨床標(biāo)本中，在本院臨床標(biāo)本尿液、痰、大便、膿液、血液、陰道分泌物、前列腺液等均有檢出。從本研究結(jié)果看，大腸埃希菌及產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌都主要來(lái)源于尿液和痰，可見在我院大腸埃希菌的感染主要見于泌尿道和呼吸道，且2010年和2011年細(xì)菌分布沒(méi)有明顯變化。

ESBLs由質(zhì)粒介導(dǎo)，可水解青霉素、頭孢菌素類及單環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素［9］，是導(dǎo)致大腸埃希菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因［10］。β-內(nèi)酰胺類抗生素包括:青霉素類抗生素(如哌拉西林、氨芐西林);頭孢菌素類抗生素(如頭孢呋辛、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶);碳青霉烯類(如亞胺培南、美洛培南);單環(huán)類抗生素(如氨曲南)。在本研究結(jié)果中，頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、哌拉西林、氨芐西林和氨曲南在兩年的研究數(shù)據(jù)中顯示的耐藥率都為100%，說(shuō)明在治療大腸埃希菌相關(guān)疾病時(shí)，使用這些藥物泛濫，使細(xì)菌完全耐藥，現(xiàn)已不再適用于大腸埃希菌所致感染的治療。提示我們應(yīng)嚴(yán)格控制青霉素類抗生素、頭孢菌素類抗生素和單環(huán)類抗生素的大量應(yīng)用。

碳青霉烯類藥物的使用是非常值得關(guān)注的，目前，國(guó)內(nèi)外均將碳?xì)涿瓜╊愃幬镆暈橹委煯a(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的首選方案。但選擇用藥時(shí)應(yīng)慎重，因?yàn)閬啺放嗄峡咕V極廣，抗菌效果極強(qiáng)，易造成耐藥菌株產(chǎn)生和真菌感染［11］。本研究的結(jié)果顯示，兩年來(lái)大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)碳?xì)涿瓜╊愃幬锏哪退幝蕿?。說(shuō)明亞胺培南對(duì)革蘭陰性桿菌具有極強(qiáng)的抗菌活性，而且我院對(duì)碳?xì)涿瓜╊愃幬锏氖褂每刂频谋容^好，建議臨床選用此類藥物。

本研究結(jié)果顯示可知:大腸埃希菌對(duì)氨基糖苷類藥物(如慶大霉素、阿米卡星)耐藥率呈不同程度的耐藥。慶大霉素的耐藥率兩年遞增，且耐藥率較高，說(shuō)明我院對(duì)慶大霉素使用量較大，需要科學(xué)的控制對(duì)此抗生素的使用。而阿米卡星對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌顯示出一定的抗菌作用，提示臨床上可以選擇阿米卡星治療產(chǎn)ESBLs菌引起的感染。

我院2010年和2011年大腸埃希菌對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物(如諾氟沙星、環(huán)丙沙星)的耐藥率一直處于高水平。可能是由于氟喹諾酮類抗菌藥物是經(jīng)驗(yàn)性治療泌尿道感染的首選藥物，也是其他部位感染的經(jīng)驗(yàn)性用藥之一，而且由于氟喹諾酮類藥物每日只需使用一次，存在著使用方便，患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)，故臨床使用頻繁［12］。因此氟喹諾酮類藥物已不適用于對(duì)大腸埃希菌感染的經(jīng)驗(yàn)治療。

大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素類(如米諾環(huán)素、四環(huán)素)也呈現(xiàn)出不同程度的耐藥。由于四環(huán)素在臨床上的使用較多較廣，導(dǎo)致其耐藥率高，建議臨床采取交替使用抗菌藥物的方案，合理使用四環(huán)素，減緩細(xì)菌對(duì)其耐藥性的發(fā)展。米諾環(huán)素的兩年耐藥率均為31%，比四環(huán)素的耐藥率低，故臨床在應(yīng)用此類藥物時(shí)，米諾環(huán)素比較適合治療產(chǎn)ESBLs菌引起的感染。

硝基呋喃類藥物(如呋喃妥因)的耐藥性較低，提示這類藥物是治療大腸埃希菌感染較好的選擇，建議臨床選用此類藥物。復(fù)方新諾明的耐藥率也很高?？赡苡捎谒悄壳盎前奉愃幬镏锌咕顝?qiáng)而且較常用的復(fù)方制劑，應(yīng)用較多。此結(jié)果提示臨床在應(yīng)用此類藥物應(yīng)斟酌再三，方法得當(dāng)。我院E.coli的耐藥率很高，情況十分嚴(yán)重，應(yīng)對(duì)E.coli進(jìn)行耐藥性動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，以指導(dǎo)臨床科學(xué)使用抗菌藥物。

［1］游春芳，周利民.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的耐藥性分析.西南軍醫(yī)，2011，13(2):196-198.

［2］Pashley RM，Mc Guiggan PM，Ninham BW，et al.A ttractive forces between uncharged hydrophobic surfaces:direct measurements in aqueous so lution.Science，1985，229:1088-1089.

［3］吳承龍.細(xì)菌耐藥性擴(kuò)散與R質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移研究.中國(guó)公共衛(wèi)生學(xué)報(bào)，1998，17(6):364.

［4］Russell AD，Chopra I.Understanding antibacterial action and resistance.2nd ed.Chichester:Ellis Ho rwood，1996:58.

［5］徐簡(jiǎn)，葛洪，馮立民，等.臨床常見致病菌對(duì)消毒劑耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，33(6):474-476.

［6］古旭東.大腸埃希氏菌感染的分布常態(tài)及其耐藥性觀察.實(shí)用醫(yī)技雜志，2008，25(9):113-115.

［7］張?zhí)K明，許平，朱莉，等.醫(yī)院感染患者分離的大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌耐藥趨勢(shì)分析.中國(guó)感染控制雜志.2007，6(2):120-124.

［8］葉應(yīng)嫵，王毓三.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程.第2版.南京:東南大學(xué)出版社，1997:472-576.

［9］Page M G.Extended-spectrum beta-lactamases:structure and kinetic mechanism.Clin Microbiol Infect，2008，14(1):63-74.

［10］潘蕓，徐瑞龍，等.大腸埃希菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)和耐藥性分析.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2007，22(2):195-197.

［11］游春芳，周利民，等.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的耐藥性分析.西南軍醫(yī)，2011，13(2):196-198.

［12］方潔，何樂(lè)，等.大腸埃希菌耐藥性與抗菌藥物使用情況的相關(guān)性分析.2011年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第11屆中國(guó)藥師周論文集，2001.