鹽酸西布曲明人工抗原的合成與鑒定

吳 昊，戴彩霞，劉 佳，何計(jì)國(guó)*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

鹽酸西布曲明人工抗原的合成與鑒定

吳 昊，戴彩霞，劉 佳，何計(jì)國(guó)*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

目的：建立鹽酸西布曲明的免疫分析方法。方法：4-氯苯乙腈和1, 3-二溴丙烷為原料合成與鹽酸西布曲明具有相同母核結(jié)構(gòu)的小分子雙去甲基西布曲明(M2)，以雙去甲基西布曲明為半抗原，并分別通過(guò)活潑酯法、戊二醛法和混合酸酐法將半抗原與牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備免疫原(M2-BSA)和包被抗原(M2-OVA)。結(jié)果：紫外光譜掃描證明半抗原M2與載體蛋白偶聯(lián)比為24.6:1(M2-BSA)和16.2:1(M2-OVA)，抗血清ELISA效價(jià)均達(dá)到1:8000以上，IC50=0.42μg/mL。結(jié)論：半抗原M2與載體蛋白均已成功偶聯(lián)，其中活潑酯法對(duì)半抗原活性基團(tuán)的影響最小，合成人工抗原的特異性最強(qiáng)。

鹽酸西布曲明；雙去甲基西布曲明；違禁添加物；免疫學(xué)分析

1997年，西布曲明獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，同類產(chǎn)品風(fēng)靡全球。自從20世紀(jì)90年代面世之后，一直存在著很大爭(zhēng)議——它可以抑制食欲，但可能增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。但由于此前一直缺乏大樣本權(quán)威實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，所以這類減肥藥一直在爭(zhēng)議聲中存在甚至熱銷。2010年1月，歐盟人用醫(yī)藥產(chǎn)品委員會(huì)(CHMP)，暫停所有含西布曲明成分的減肥藥在歐盟地區(qū)銷售使用[3-4]。10月8日，美國(guó)FDA發(fā)文，責(zé)令含此類藥物的產(chǎn)品撤出美國(guó)市場(chǎng)。2010年10月30日，中華人民共和國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局宣布國(guó)內(nèi)停止生產(chǎn)、銷售和使用西布曲明制劑和原料藥，撤銷其批準(zhǔn)證明文件，已上市銷售的藥品由生產(chǎn)企業(yè)負(fù)責(zé)召回銷毀。但因其價(jià)格低廉，仍有不法商販將其添加到減肥保健品中。

目前保健食品中西布曲明的檢測(cè)方法包括薄層色譜法[5]、高效液相色譜[6]、二極管陣列檢測(cè)法[7]、LC-MSMS聯(lián)用技術(shù)等[8]，這些方法準(zhǔn)確可靠，但樣品前處理復(fù)雜，對(duì)儀器設(shè)備的要求也比較嚴(yán)格。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)食品藥品中添加的鹽酸西布曲明，方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，適用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控，是保健食品中違法添加西藥監(jiān)管的重要技術(shù)支撐。江南大學(xué)胥傳來(lái)等[9]合成了一種適用于鹽酸西布曲明的免疫原，但未見(jiàn)抗原免疫學(xué)特征鑒定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用雙去甲基西布曲明(M2)作為半抗原，將其與載體蛋白偶聯(lián)制備相應(yīng)的人工抗原并進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，為下一步單克隆抗體的制備提供可靠的免疫原和包被原。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白(BSA)(第五組分，含量＞98%)、卵清蛋白(OVA)(第五組分，98%)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 美國(guó)Sigma公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1,4-二氧六環(huán) 北京化工廠；三正丁胺 北京益利精細(xì)化工品有限公司；氯甲酸異丁酯 美國(guó)Alfa Aesar公司；4-氯苯乙腈、1,3-二溴丙烷、對(duì)乙基-N,N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ；Tween-20(純度＞98.0%)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 美國(guó)Fluka公司；0.01mol/L pH7.4 的PBS溶液(磷酸緩沖液)、考馬斯亮藍(lán)染液、包被緩沖液(0.05mol/L pH9.6 的碳酸鹽緩沖液)、封閉液(含1%明膠的0.05mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液)、洗滌液PBST(含0.05% Tween-20的0.01mol/L，pH7.4的PBS)、底物緩沖液(pH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液)、底物TMB(2mg/mL DMSO)、終止液(2mol/L H2SO4)均為實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板 美國(guó)Costar公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；FA1004電子分析天平 北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；JB-1磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司；722S分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡Balb/c小鼠，雌性，體質(zhì)量18～22g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 方法

1.4.1 雙去甲基西布曲明半抗原的合成[10]

1.4.1.11 -( 4-氯苯基)環(huán)丁腈的制備

在100mL的三頸瓶中，裝入含9.6g氫氧化鉀(細(xì)粉)的 30mL 二甲亞砜懸浮液，將 4-氯苯乙腈15.15g (0.10mol)和1,3-二溴丙烷 21.2g(0.11mol)溶于 50mL 乙醚，倒入100mL的恒壓漏斗中，于20～25℃ 充分?jǐn)嚢柘聦⒋巳芤郝稳肴i瓶中，同時(shí)通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，滴畢后繼續(xù)攪拌30min，滴加冰水20mL于反應(yīng)混合物中，再加入100mL乙醚，經(jīng)硅藻土過(guò)濾、濾渣用乙醚洗滌、合并濾液和洗滌液到分液漏斗，棄去水層，油層用100mL乙醚提取2次。合并醚層并用100mL水洗滌3次，無(wú)水硫酸鎂干燥。 蒸干乙醚，殘余物為橙色油狀物，減壓蒸餾(168～169℃，2666Pa)得無(wú)色油狀物。

1.4.1.21 -[1-( 4-氯苯基)環(huán)丁基]-3-甲基丁胺的制備(雙去甲基西布曲明的制備)

格氏試劑制備：在三頸瓶中將鎂粉4.8g(0.198mol)邊攪拌邊滴加到無(wú)水乙醚(80mL)中，再將異丁基溴 31.5g (0. 23mol) 緩慢加入到上述混合液中，此混合液即為異丁基溴化鎂溶液。

將1-(4-氯苯基)環(huán)丁腈25g (0.13mol)溶于100mL 干燥甲苯中，將此溶液滴入異丁基溴化鎂溶液中。并通過(guò)蒸餾除去乙醚，調(diào)整滴加速度使之與蒸餾速度與大致相等，以保證滴定完畢時(shí)乙醚亦蒸除?；旌衔镌?0℃攪拌 18h后停止加熱，將反應(yīng)物加到15g (0.39mol)熱硼氫化鈉-500mL 異丙醇的懸浮液中，得到的混合物加熱回流6h，室溫放置18h后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，殘余物加500mL 水混勻，放置30min，用100mL乙酸乙酯分別提取3次。酯層用100mL的水洗滌2次，無(wú)水硫酸鎂干燥，蒸干溶劑，得淡黃色油狀物，總反應(yīng)式見(jiàn)圖1。

圖1 雙去甲基西布曲明合成路線Fig.1 Synthetic route of N,N-didesmethyl sibutramine hydrochloride

1.4.2 人工抗原的制備

1.4.2.1 活潑酯法[11]

免疫原(EDC-BSA)的合成采用BSA為載體，合成路線見(jiàn)圖2。稱取88.0mg BSA 加入10mL磷酸鹽緩沖液中，待BSA溶解后加入34.5mg(0.3mmol) NHS(溶于100μL DMF)和46.6mg(0.3mmol) EDC(溶于100μL DMF)，室溫下攪拌過(guò)夜。稱為A液。半抗原M2 88mg(0.35mmol)溶于100μL DMF中，稱為B液。并將B液邊攪拌邊逐滴加入到A液中，滴畢后4℃攪拌過(guò)夜。反應(yīng)液于4℃冰箱中用pH7.4的PBS透析72h，每8h換液一次。另以O(shè)VA為載體蛋白，同法合成人工包被原(EDC-OVA)。

圖2 活潑酯法人工免疫原的合成路線Fig.2 Synthetic route of immunogen using active ester method

1.4.2.2 戊二醛法[12]

免疫原(W-BSA)的合成采用BSA為載體，合成路線見(jiàn)圖3。稱取44.0mg BSA加入到8mL磷酸鹽緩沖液中，充分溶解后，逐滴加入100μL戊二醛于反應(yīng)液中，4℃攪拌3h后將反應(yīng)液至于經(jīng)處理的透析袋中，于pH7.4的PBS中透析18h，6h換液一次，稱為A液。稱取半抗原M2 50.2mg(0.20mmol)溶于100μL DMF中，并將其在4℃條件下邊攪拌邊緩慢滴加入A液中，滴畢，4℃冰箱中攪拌過(guò)夜，次日將反應(yīng)液與pH7.4的PBS中透析72h。另以O(shè)VA為載體蛋白，同法合成人工包被原(W-OVA)。

圖3 戊二醛法人工免疫原的合成路線Fig.3 Synthetic route of immunogen using glutaraldehyde method

1.4.2.3 混合酸酐法[9]

混合酸酐法制備人工抗原(M-BSA)，合成路線見(jiàn)圖4。稱取25.1mg(0.10mmol)半抗原M2溶于溶有5mg (0.05mmol)丁二酸酐的吡啶溶液中，室溫避光攪拌24h，用氮?dú)獯蹈珊笤偌尤隓MF 0.6mL，使其充分溶解。取三正丁胺10μL(0.04mmol)溶于100μL DMF中，在冰浴下邊攪拌邊逐滴加于上述溶液。再將氯甲酸異丁酯6μL (0.04mmol)溶于100μL DMF中，與上述溶液攪拌反應(yīng)2h，將上述反應(yīng)液稱為A液。稱取60mg BSA溶于10mL磷酸鹽緩沖液中，在冰浴下，邊攪拌邊將A液緩慢逐滴加入到B液中，4℃攪拌過(guò)夜。次日將反應(yīng)液于處理過(guò)的透析袋中，透析72h，8h換液一次。

另以O(shè)VA為載體蛋白，同法合成M-OVA。

圖4 混合酸酐法人工免疫原的合成路線Fig.4 Synthetic route of immunogen using mixed anhydride method

1.4.3 人工抗原的鑒定

1.4.3.1 人工抗原中BSA含量的測(cè)定(考馬斯亮藍(lán)G-250法)

按表1的數(shù)據(jù)配制0、0.02、0.04、0.06、0.08、1mg/mL BSA溶液，分別加入6個(gè)7mL離心管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻數(shù)次后靜置2min后，在波長(zhǎng)595nm處比色，測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定人工抗原中BSA含量。同法分別將3種不同方法合成的免疫原(統(tǒng)稱M2-BSA)和包被原(統(tǒng)稱M2-OVA)溶液(10倍稀釋)與考馬斯亮藍(lán)G-250比色后測(cè)定OD值。

表1 免疫方案Table 1 Immunization protocols

1.4.3.2 偶聯(lián)物的鑒定與偶聯(lián)比的計(jì)算[13]

利用紫外全波長(zhǎng)掃描的化學(xué)方法鑒定人工抗原是否合成，根據(jù)偶聯(lián)物中所測(cè)蛋白的質(zhì)量濃度，分別將小分子質(zhì)量濃度調(diào)至0.05mg/mL，載體蛋白和偶聯(lián)物質(zhì)量濃度調(diào)至0.5mg/mL，并將上述溶液在波長(zhǎng)190～400nm掃描其紫外吸收，根據(jù)掃面圖譜進(jìn)行偶聯(lián)產(chǎn)物的鑒定。

ca/cb為偶聯(lián)物中M2和BSA的偶聯(lián)物質(zhì)的量比。在載體蛋白和半抗原的最大波長(zhǎng)處檢測(cè)偶聯(lián)物的光吸收值，按公式(1)計(jì)算兩種物質(zhì)在偶聯(lián)物中的濃度比，即偶聯(lián)比：

式中：A266nm為抗原在小分子最大吸收波長(zhǎng)266nm處的吸光度；A＇278nm為BSA在其最大吸收波長(zhǎng)278nm處的吸光度；AB266nm為BSA在小分子最大吸收波長(zhǎng)266nm處的吸光度；A＇266nm為小分子在其最大吸收波長(zhǎng)266nm處的吸光度；AM278nm為小分子在BSA最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；A278nm為偶聯(lián)物在BSA最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度；c1為小分子標(biāo)準(zhǔn)物濃度/(mol/L)；c2為BSA標(biāo)準(zhǔn)物濃度/(mol/L)。M2-OVA偶聯(lián)物鑒定時(shí)，將BSA替換成OVA即可，方法同上。

1.4.4 動(dòng)物免疫

選取6～8周齡的健康Balb/c雌性小鼠20只，將其中的18只隨機(jī)分成3組，每組6只，分別用于EDC-BSA、W-BSA和M-BSA的免疫，另2只用于陰性血清的制備。各劑量組的免疫劑量均為100μg/只。免疫原與弗氏佐劑等體積混合。用5mL的注射器將混合液充分乳化后免疫動(dòng)物，免疫周期為2周。第3次免疫后10d采血，并對(duì)抗血清進(jìn)行鑒定。如效價(jià)未達(dá)到要求可間隔兩周后加強(qiáng)免疫一次。融合前3d，用不加佐劑的免疫原生理鹽水溶液腹腔注射，進(jìn)行終免。具體免疫方案如表1所示。

1.4.5 抗血清的測(cè)定

第3次免疫后10d，小鼠內(nèi)眥靜脈采血0.1mL。室溫靜置1h，4℃冰箱過(guò)夜，3000r/min離心15min，收集血清，4℃保存。

1.4.5.1 抗血清效價(jià)的測(cè)定

將抗血清分別稀釋成2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000、512000倍，每個(gè)稀釋倍數(shù)均作3個(gè)平行孔，另設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照和一個(gè)空白對(duì)照(用樣品稀釋液代替)。血清稀釋一定倍數(shù)至其測(cè)得的OD值是陰性血清最大OD值的2.1倍時(shí)，這個(gè)稀釋倍數(shù)就是該血清的效價(jià)，所用波長(zhǎng)為450nm。

1.4.5.2 最佳包被質(zhì)量濃度和抗血清稀釋倍數(shù)的確定

用包被緩沖液將包被原作系列稀釋，質(zhì)量濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.0625μg/mL；用樣品稀釋液將抗血清作倍比稀釋，分別為1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:32000。將包被原按質(zhì)量濃度遞減的順序在酶標(biāo)板上從上排到下排依次加入，將抗血清按稀釋倍數(shù)遞增的順序從左到右依次加入。按間接ELISA方法測(cè)定，最后選取OD450nm在1.5左右，且處在曲線平臺(tái)下降的那一點(diǎn)的稀釋倍數(shù)作為抗原抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

1.4.5.3 抗血清與西布曲明包被原及西布曲明小分子的相對(duì)親和力測(cè)定

根據(jù)確定的最佳條件，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定鹽酸西布曲明小分子與西布曲明包被原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗血清的能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的質(zhì)譜鑒定

采用飛行質(zhì)譜可以測(cè)定待測(cè)物的相對(duì)分子質(zhì)量，合成產(chǎn)物的質(zhì)譜見(jiàn)圖5。

圖5 半抗原M2的質(zhì)譜圖Fig.5 MS spectrum of hapten M2

由圖5可見(jiàn)，最強(qiáng)峰m/z為252.8，是合成產(chǎn)物的離子峰[M+H]+(M為合成產(chǎn)物)，與目標(biāo)產(chǎn)物半抗原HP的理論相對(duì)分子質(zhì)量(251.5)相符。表明通過(guò)反應(yīng)生成了相對(duì)分子質(zhì)量與目標(biāo)物分子質(zhì)量一致的新物質(zhì)，結(jié)合反應(yīng)路線，可以推斷合成產(chǎn)物即為所需的目標(biāo)產(chǎn)物M2，說(shuō)明該合成路線可以用于鹽酸西布曲明半抗原的合成。

2.2 人工抗原的紫外掃描結(jié)果分析

半抗原與載體蛋白均具有各自的紫外吸收特征，因此其偶聯(lián)物應(yīng)兼具有二者的紫外吸收特征，因此，通過(guò)紫外掃描可以判斷人工抗原是否偶聯(lián)成功。M2、BSA(OVA)和偶聯(lián)物的紫外吸收掃描圖見(jiàn)圖6。反應(yīng)產(chǎn)物的吸收峰是底物M2、BSA的吸收峰的疊加，M2已成為BSA的一個(gè)特征結(jié)構(gòu)即抗原決定簇，初步鑒定免疫原合成成功，還有待于用動(dòng)物免疫進(jìn)一步證實(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物的吸收峰是底物M2、OVA的吸收峰的疊加，M2已成為OVA的一個(gè)特征結(jié)構(gòu)即抗原決定簇，包被原合成成功。

圖6 3種免疫原(M2-BSA)的紫外掃描圖譜Fig.6 UV scanning spectra of HP, BSA and M2-BSA

2.3 人工抗原的蛋白質(zhì)量濃度和偶聯(lián)比

通過(guò)計(jì)算得到人工抗原的蛋白質(zhì)量濃度和偶聯(lián)比，結(jié)果見(jiàn)表2。初步證明了，利用3種方法小分子都已和載體蛋白偶聯(lián)上。

表2 人工抗原的蛋白質(zhì)量濃度和偶聯(lián)比測(cè)定結(jié)果Table 2 Protein concentrations and conjugation ratios of artificial antigens

2.4 人工抗原的免疫分析鑒定

2.4.1 血清效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

效價(jià)為抗血清OD450nm是陰性對(duì)照孔OD450nm2.1倍時(shí)的稀釋倍數(shù)。三免后分別用不同的包被原對(duì)不同免疫原免疫的小鼠進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，效價(jià)理想的結(jié)果見(jiàn)表3。表明3種方法合成的人工抗原都刺激小鼠產(chǎn)生了抗體。

表3 以不同包被原測(cè)定小鼠血清效價(jià)的結(jié)果Table 3 Titers of antisera as determined using different M2-OVA as coating antigens

2.4.2 方陣滴定法測(cè)定最佳包被質(zhì)量濃度和血清稀釋倍數(shù)

選取OD450nm值最接近1.5的陽(yáng)性孔所對(duì)應(yīng)的包被原質(zhì)量濃度和血清稀釋倍數(shù)作為ELISA實(shí)驗(yàn)工作質(zhì)量濃度。不同包被原和免疫原的最佳工作條件見(jiàn)表4。

表4 不同包被原和免疫原的最佳工作條件Table 4 Optimal working concentrations of different coating antigens and antibodies

2.4.3 抗血清與西布曲明包被原及西布曲明小分子的相對(duì)親和力

相對(duì)親和力是指小分子物質(zhì)能夠從包被原上競(jìng)爭(zhēng)抗體的能力，是反映抗體的最低檢出限的指標(biāo)。根據(jù)方陣滴定法確定的最佳包被抗原質(zhì)量濃度和抗體稀釋倍數(shù)，對(duì)表3中較為理想的組合進(jìn)行抗血清與西布曲明包被原及西布曲明小分子的相對(duì)親和力測(cè)定。測(cè)定結(jié)果為EDC-BSA與M-OVA的IC50=0.71μg/mL，EDC-BSA與W-OVA的IC50=0.42μg/mL，EDC-BSA與EDC-OVA的IC50=2.5μg/mL。表明EDC-BSA免疫的抗血清和W-OVA為包被原的最低檢出限最低，其抑制曲線見(jiàn)圖7。

圖7 以W-OVA為包被原，西布曲明對(duì)以EDC-BSA為免疫原6號(hào)小鼠抗血清抑制曲線Fig.7 The inhibition curve of sibutramine to No.6 mouse antiserum using EDC-BSA as immunogen and M-OVA as coating antigen

由圖7可見(jiàn)，西布曲明質(zhì)量濃度在150～3000ng/mL之間時(shí)，lgρ西布曲明與OD值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明該抗血清的檢出范圍為150～3000μg/kg，最低檢出限為150μg/kg。

3 討 論

采用傳統(tǒng)的有機(jī)合成方法，合成了半抗原雙去甲基西布曲明。該合成的關(guān)鍵是反應(yīng)前的試劑脫水和反應(yīng)中的4-氯苯乙腈與1,3-二溴丙烷混合乙醚溶液的滴加速度及回收中的減壓蒸餾，由于把握住實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟，其產(chǎn)物的純度較高(95%)。在得到了半抗原雙去甲基西布曲明后，分別用3種方法進(jìn)行了半抗原和載體蛋白的連接，由于在活潑酯法的反應(yīng)是在酰胺類體系中進(jìn)行，而參加反應(yīng)的均為脂溶性較高物質(zhì)，其產(chǎn)物具有共軛性極強(qiáng)酰胺基團(tuán)，因此與其他兩種方法相比與BSA形成氫鍵的幾率高[15]，與OVA結(jié)合能力強(qiáng)，因此得到的抗血清效價(jià)最高，且產(chǎn)生的抗體與西布曲明包被原及西布曲明小分子的相對(duì)親和力最強(qiáng)，最低檢出限低于其他方法獲得的抗體。

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Synthesis and Characterization of Artificial Antigen for Sibutramine Hydrochloride

WU Hao，DAI Cai-xia，LIU Jia，HE Ji-guo*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In order to establish an immunoanalytical method for the detection of sibutramine hydrochloride, the hapten of N,N-didesmethyl sibutramine hydrochloride (M2) was synthesized from 4-chlorophenylacetonitrile and 1,3-dibromopropane and then conjugated to the carrier protein of bovine serum albumin (BSA) or ovalbumin (OVA) by active ester method, glutaraldehyde method or mixed anhydride method to prepare immunogens and coating antigens. The results indicated that the coupling ratios of M2-BSA and M2-OVA were 24.6:1 and 16.2:1 as indicated by UV spectroscopic analysis. The antisera displayed high-level affinity to each coating antigen with a titer of more than 1:8000 and an IC50of 0.42 μg/mL. Therefore, M2 hapten and carrier proteins were successfully conjugated. The active ester method revealed the smallest damage on the reactive groups of the hapten and the highest specificity. These results suggested that the artificial antigens could be used for the preparation of monoclonal antibodies.

sibutramine hydrochloride；N, N-didesmethyl sibutramine hydrochloride (M2)；prohibited additives；immunoassay

TS201.6

A

1002-6630(2012)03-0140-06

2011-04-08

吳昊(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與食品安全。E-mail：1987christina@sina.com

*通信作者：何計(jì)國(guó)(1966—)，男，副教授，研究方向?yàn)楣δ苁称芬约笆称钒踩珯z測(cè)。E-mail：hejiguo0870@sina.com