• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    微量測定木聚糖酶活力的新方法
    ——MBTH法

    2012-10-27 06:09:32張永勤曾凡偉王哲平
    食品科學 2012年3期
    關(guān)鍵詞:木糖聚糖產(chǎn)物

    張永勤,王 斐,曾凡偉,王哲平,張 杰,趙 鑫,程 千

    (青島科技大學化工學院,山東 青島 266042)

    微量測定木聚糖酶活力的新方法
    ——MBTH法

    張永勤,王 斐,曾凡偉,王哲平,張 杰,趙 鑫,程 千

    (青島科技大學化工學院,山東 青島 266042)

    建立一種木聚糖酶活力的微量測定新方法——3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法。根據(jù)木聚糖及其酶解產(chǎn)物的特殊性,研究MBTH法的顯色條件,并以多點測定法對酶活力測定中的幾個關(guān)鍵參數(shù)進行探討。結(jié)果表明:蛋白質(zhì)在其質(zhì)量濃度低于30μg/mL時對測定無干擾;木聚糖溶液的最佳測定質(zhì)量濃度為4mg/mL;較高的酶解溫度會使木聚糖酶在測定過程中失活,因此,酶活力測定的最佳溫度為30℃,而遠低于該酶的最適溫度;酶解時間為60min以內(nèi);酶解產(chǎn)物與MBTH試劑的反應時間應控制在13~16min之間,以15min為最佳。以酶解時間為30min計,本法檢測限為0.135mU/mL,定量限為0.451mU/mL,適當延長酶解時間可相應提高酶活力檢測靈敏度。該法準確度高,結(jié)果穩(wěn)定,靈敏度遠高于DNS法。

    木聚糖酶;M B T H;活力;木聚糖;木糖;測定

    木聚糖是一種多聚五碳糖,是植物半纖維素的重要組成成分,是自然界中繼纖維素之后含量第二豐富的可再生資源。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子中β-1,4木糖苷鍵的酶系,是可將木聚糖水解為低聚木糖、木寡糖、木二糖以及少量阿拉伯糖和木糖的一種復雜的復合酶系統(tǒng)[1],因而廣泛應用于生物能源、食品、飼料、制藥、制漿、造紙、紡織等行業(yè)中,已成為國內(nèi)外眾多學者的研究熱點[2-5]。

    酶活力是衡量酶生物活性的重要指標,也是控制木聚糖酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)。目前常用DNS法[6-8]測定其酶活力,此法雖然簡便、快捷,但靈敏度相對較低,特別不適用于酶含量極低的含酶材料的酶活力測定。本實驗所采用的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法常用于檢測酚類和醛類化合物[9-10],以及漆酶和錳過氧化物酶活力的測定[11-12],MBTH還可與含羰基的化合物反應[13],且測定不受低濃度醋酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液的干擾,因此可用于檢測木聚糖酶活力。由于該法靈敏度較高,在木聚糖酶解程度極低的條件下即可測得酶活力,而水解產(chǎn)物中大分子糖鏈的還原端基不會因分子質(zhì)量的略微變化而有大的反應性改變,即不同聚合度的同類還原糖,其還原端的顯色吸光系數(shù)基本相同,因此,所得活力測定數(shù)值不會像DNS法那樣偏離測定真值[14-15]。近年來有人將其應用于幾丁質(zhì)酶、溶菌酶的活力測定[16],而將其用于木聚糖酶的活力測定還是一種新的嘗試。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    木聚糖酶(最適pH值為5.5) 和氏璧生物技術(shù)有限公司;木糖、木聚糖(來源于櫸木)、3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)、二硫蘇糖醇(DTT) 美國Sigma公司。

    SHZ-82水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;FE 20數(shù)字酸度計 梅特勒-托利多儀器有限公司;UNICO 2100紫外-可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;移液器 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 木聚糖溶液的配制

    準確稱取木聚糖0.8000g于100mL燒杯中,逐滴加入50mL水,使其浸潤并分散于水中,于80℃加熱直至完全溶解,冷卻至室溫,轉(zhuǎn)移至容量瓶中,并以水定容至50mL。以0.1mol/mL pH5.5的醋酸緩沖溶液為溶劑,將定容好的木聚糖溶液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,并定容至100mL,充分混勻,配成8mg/mL的木聚糖溶液于4℃貯藏備用。

    1.2.2 還原糖濃度的測定及木糖標準曲線的繪制

    以MBTH為氧化劑代替通常采用的DNS來測定還原糖濃度,其原理為,MBTH首先與還原糖反應生成嗪,過量的MBTH被Fe3+氧化成氧離子,在與嗪反應生成青藍色化合物,在一定范圍內(nèi),還原糖的量和反應液的顏色強度呈正比關(guān)系,通過測定波長650nm處的吸光度表示還原糖濃度。在相同的還原糖濃度條件下,MBTH的氧化產(chǎn)物不同于DNS的氧化產(chǎn)物(橙黃-棕紅色的氨基化合物),且其色度明顯深于后者。

    MBTH法:參照木糖質(zhì)量濃度測定方法[17]并略加改動。取0.6mL木糖溶液或酶解液加入到0.6mL 0.5mol/mL NaOH溶液中,充分混勻,加入0.6mL MBTH試劑(3mg/mL MBTH溶液和1mg/mL DTT溶液等量混合即得,現(xiàn)用現(xiàn)配),混勻后于80℃水浴中加熱15min 后趁熱加入1.2mL硫酸鐵銨試劑(0.5g/100mL (FeNH4(SO4)2)·12H2O、0.5%氨基磺酸、0.5mol/L鹽酸),顯色穩(wěn)定后于650nm波長處測定其吸光度。每個樣品做3個平行樣(以下同)。其中,用于標準曲線的繪制的0.6mL木糖溶液(0~30 μ g/mL)由0.3mL的木聚糖溶液(1.2.1節(jié)配制)和0.3mL的具有不同質(zhì)量濃度系列的木糖溶液(0~60 μg/mL)構(gòu)成。

    DNS法:參照國家標準GB/T 23874——2009《飼料添加劑木聚糖酶的活力的測定》[18]。

    1.2.3 蛋白質(zhì)對還原糖濃度測定的影響

    將2mg/mL牛血清白蛋白溶液以對倍稀釋法配制成不同質(zhì)量濃度溶液,再分別與20 μg/mL木糖標準溶液等體積混合,按照1.2.2節(jié)的方法測定還原糖濃度。

    1.2.4 酶活力測定

    多點測定法(罐法):用于考察溫度、時間對酶活力測定的影響。將預熱至一定溫度的0.1mL木聚糖酶溶液(以50mmol/mL pH5.5的醋酸溶液為溶劑)加入到預熱至相同溫度的9.9mL 4mg/mL木聚糖溶液中起始酶解反應,定時取出2mL酶解液加入到2mL 0.5mol/L的NaOH溶液中以終止反應,充分混勻,分別取出1.2mL(做3個平行樣),參照1.2.2節(jié)的方法測定還原糖濃度。在考察溫度對酶活力測定的影響和MBTH顯色反應時間對酶活力測定的影響中,木聚糖酶質(zhì)量濃度均為10μg/mL(即終質(zhì)量濃度均為0.1μg/mL),后者的酶解時間為20min左右。

    終點測定法(試管法):用于常規(guī)活力測定。將預熱至30℃的0.3mL木聚糖酶溶液加入到預熱至相同溫度的0.3mL木聚糖溶液中充分混合以起始酶解反應(混合后木聚糖溶液質(zhì)量濃度為4mg/mL),30min后,準時加入0.6mL 0.5mol/L的NaOH溶液中以終止酶解反應,充分混勻,參照1.2.2節(jié)的方法測定還原糖濃度。在考察酶解產(chǎn)物顯色后的穩(wěn)定性實驗中,木聚糖酶質(zhì)量濃度均為0.2μg/mL (即終質(zhì)量濃度為0.1μg/mL)。

    酶活力單位可被定義為:在上述條件下,使每毫升酶解液中每分鐘產(chǎn)生1μmoL相當于木糖的還原糖的量為1個酶活力單位。

    1.2.5 酶質(zhì)量濃度曲線的建立及方法驗證初步

    以0.05mol/L的醋酸緩沖液(pH5.5)為溶劑配制不同質(zhì)量濃度的木聚糖酶溶液,使木聚糖酶在酶解液中的終質(zhì)量濃度分別為0、0.01、 0.03、 0.05、 0.07、 0.1、 0.15、0.2、 0.3μg/mL,參照1.2.4節(jié)的多點測定法進行酶活力測定。檢測限(DL)和定量限(QL)是由回歸直線方程確定[19],由方程(1)和(2)計算所得。

    式中:Sb1是10個空白溶液的標準偏差;b為回歸方程的斜率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 木糖標準曲線的繪制

    木聚糖酶可催化木聚糖水解產(chǎn)生具有還原性木糖端基的低聚木聚糖,通過測定其還原端基或還原糖濃度的增加速率即可推算酶活力。以MBTH為氧化劑代替通常采用的DNS來測定還原糖濃度。

    圖1 木糖標準曲線Fig.1 Standard curves of xylose prepared using DNS or MBTH as oxidizer

    由圖1可知,其測定的靈敏度高于DNS法10倍以上。由于酶活力測定的靈敏度取決于相應還原糖測定的靈敏度,因此,利用MBTH法進行木聚糖酶活力的測定可顯著提高測定靈敏度。針對MBTH 法測定木聚糖酶解產(chǎn)物還原端基以及木聚糖酶活力測定的具體特點,實驗對木聚糖酶活力測定中的幾個關(guān)鍵參數(shù)進行了研究。

    2.2 蛋白質(zhì)對酶活力測定的影響

    有些多糖水解酶活力測定方法如BCA法[20],其檢測試劑會與蛋白質(zhì)發(fā)生顯色反應,從而致使酶本身對顯色反應產(chǎn)生干擾,因此需考察蛋白質(zhì)對MBTH法測定的干擾情況。由于木聚糖的酶水解產(chǎn)物的還原端基為木糖,所以以木糖為例,配制不同蛋白質(zhì)量濃度相同木糖質(zhì)量濃度(10μg/mL)的木糖標準溶液,來考察蛋白質(zhì)對該方法的干擾情況,結(jié)果如圖2所示。當?shù)鞍踪|(zhì)量在250μg/mL以上時,白蛋白對測定干擾嚴重,而低于30μg/mL時,基本無干擾。在實驗文所建立的木聚糖酶活力測定方法中,木聚糖酶的質(zhì)量濃度在5μg/mL以下,因此不會干擾酶活力測定。

    圖2 蛋白質(zhì)對還原糖測定的影響Fig.2 Effect of protein concentration on the determination of reducing sugar

    2.3 MBTH顯色反應時間對酶活力測定的影響

    圖3 MBTH與還原糖端基反應時間對酶活力測定的影響Fig.3 Effect of reaction time between MBTH and reducing sugar ends on the determination of xylanase activity

    考察MBTH與酶解產(chǎn)物反應的時間對測定的影響,分別測定80℃水浴條件下,反應5、10、15、20、25、30、35、40min 時反應產(chǎn)物吸光度的變化,結(jié)果見圖3,反應時間為13~16min內(nèi)吸光度基本保持恒定,為了減少木聚糖本身的非酶熱降解程度,因此顯色反應時間定為15min。

    2.4 反應產(chǎn)物顯色后的穩(wěn)定性

    考察顯色反應后溶液吸光度隨時間的變化,分別測定顯色反應后室溫放置不同時間的吸光度,結(jié)果見表1。盡管顯色后試劑空白與樣品的吸光度都會略有變化,但減去空白后的樣品吸光度在1~5h內(nèi)變化較小。

    表1 顯色反應后的產(chǎn)物穩(wěn)定性Table 1 Stability of chromogenic reaction products

    2.5 酶解溫度和時間對酶活力測定的影響

    由于酶的最適溫度是由多種因素相互影響而產(chǎn)生的綜合結(jié)果,因此,用于酶活力測定的酶解溫度不能簡單地以酶的最適溫度為測定條件。以木聚糖酶為例考察不同酶解溫度和時間條件下的酶解動力學。

    圖4 酶解溫度和時間對酶活力測定的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the determination of xylanase activity

    由圖4可知,在相同酶解時間內(nèi),盡管在37、45、55℃條件下所得酶解產(chǎn)物都明顯多于30℃,但是由于酶解速率隨時間延長而逐漸降低,按照常規(guī)所采用的試管法(終點法)很難準確測得酶解初速率。這主要是因為高溫容易使蛋白質(zhì)變性,從而引起酶活力降低,而且,溫度越高,酶蛋白變性越明顯。而酶解溫度為30℃時,曲線方程為一階線性方程,即為零級反應,產(chǎn)物生成速率基本保持恒定,在60min內(nèi)不受時間和底物質(zhì)量濃度的影響。而當溫度低于30℃時(如25℃),首先底物木聚糖溶液的黏度較高,底物與酶很難充分混合,從而影響酶解動力學進程;其次低溫下木聚糖酶活力較低,會降低測定的靈敏度;另外,對測定的環(huán)境條件以及實驗設備會有更高的要求,較難達到。因此木聚糖酶初速率的最佳測定溫度為30℃,時間在60min以內(nèi)。也有文獻選擇在37℃條件下進行酶解測定,由圖4可知,酶解時間最好不要超過20min。但對于熱穩(wěn)定性較高的木聚糖酶,則可使用37℃,并可適當延長酶解時間。

    2.6 底物質(zhì)量濃度對酶活力測定的影響

    由圖5可知,隨著木聚糖底物質(zhì)量濃度的升高,還原糖生成速率逐漸升高,當木聚糖質(zhì)量濃度為2.5~4mg/mL時還原糖生成速率基本保持穩(wěn)定。由于定量測定酶活力一般要求底物質(zhì)量濃度盡可能大,但考慮到底物質(zhì)量濃度過大時,其自身還原糖濃度較高從而使本底顏色過深而影響測定,因此,確定木聚糖質(zhì)量濃度為4mg/mL,以便于木聚糖酶初速率的測定。

    圖5 木聚糖質(zhì)量濃度對酶活力測定的影響Fig.5 Effect of xylan concentration on the determination of xylanase activity

    2.7 酶質(zhì)量濃度對酶活力測定的影響及酶質(zhì)量濃度標準曲線的建立

    圖6 不同酶質(zhì)量濃度條件下的動力學曲線Fig.6 Kinetic curve of xylanase with various concentrations

    圖7 木聚糖酶質(zhì)量濃度曲線Fig.7 Calibration curve of xylanase concentration

    由圖6可知,在該酶質(zhì)量濃度范圍內(nèi)酶解動力學曲線呈線性,為零級反應,酶解速率與底物質(zhì)量濃度無關(guān),因此,可視為酶解初速率。以在上述條件下酶解30min所測酶解液中木聚糖酶活力的線性回歸方程(吸光度-木聚糖酶質(zhì)量濃度)為y=2.8426x+0.0084,R2=0.9983,如圖7所示。其木聚糖酶質(zhì)量濃度檢測限為0.00316μg/mL,根據(jù)線性回歸方程(還原端基酶解初速率-酶質(zhì)量濃度) y=22.065x+0.0656, 其酶活力檢測限為0.135mU/mL,則定量限為0.451mU/mL。由于酶活力檢測的靈敏度取決于還原糖測定的靈敏度,因此,可通過適當延長酶解時間來測定較低的酶質(zhì)量濃度。

    3 結(jié) 論

    利用多點測定法研究了木聚糖酶的酶解參數(shù),并優(yōu)化了酶解產(chǎn)物的顯色條件,從而建立了木聚糖酶活力定量測定的新方法—MBTH法。其最佳測定條件為:在木聚糖酶的最適pH值條件下,木聚糖酶酶解溫度為30℃,底物質(zhì)量濃度4mg/mL,酶解時間在60min以內(nèi);在80℃條件下酶解產(chǎn)物與MBTH的反應時間應控制在13~16min之間,以15min為最佳。通過多點測定法對整個酶解過程的動力學研究,優(yōu)化測定參數(shù),以保證在一定酶解時間內(nèi)使酶解速率保持恒定,從而可以將測定參數(shù)應用于試管法(終點法)以保證酶活力測定的準確性。

    [1]楊浩萌, 姚斌, 范云六. 木聚糖酶分子結(jié)構(gòu)與重要酶學性質(zhì)關(guān)系的研究進展[J]. 生物工程學報, 2005, 21(1): 7-10.

    [2]湯斌, 陳中碧, 張慶慶, 等. 玉米秸稈發(fā)酵燃料乙醇預處理條件的優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(6): 65-67.

    [3]聶國興, 華雪銘, 王俊麗, 等. 小麥基礎飼料添加木聚糖酶對尼羅羅非魚腸道菌群的影響[J]. 水產(chǎn)學報, 2009, 33(5): 805-812.

    [4]李武光, 李新平, 杜敏. 木聚糖酶對漂白針葉木漿改性的研究[J]. 造紙科學與技術(shù), 2009, 28(4): 20-22.

    [5]任延剛, 朱啟忠, 劉新穎. 木聚糖酶的制備及應用研究[J]. 飼料研究, 2009(9): 18-20.

    [6]張永勤, 薛長湖, 湯浩源, 等. 還原糖的可見分光光度法研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(5): 97-100.

    [7]LI Lite, TIAN Hongmei, CHENG Yongqiang, et al. Purification and characterization of a thermostable cellulase-free xylanase from the newly isolated Paecilomyces themophila[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38: 780-787.

    [8]蘇玉春, 陳光, 白晶, 等. 雙水相法提取木聚糖酶的初步研究[J]. 食品科學, 2009, 30(5): 214-216.

    [9]MARIE P, MIROSLAV P, DRAHOMIRA S. Spectrophotometric study of reactions of substituted phenols with MBTH in alkaline medium: the effect of phenol structure on the formation of analytically useful coloured products[J]. Mikrochim Acta, 1998, 129: 201-208.

    [10]TODA K, YOSHIOKA K I, MORI K, et al. Portable system for near-real time measurement of gaseous formaldehyde by means of parallel scrubber stopped-flow absorptiometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2005, 531: 41-49.

    [11]NAGARAJA P, SHIVAKUMAR A, SHRESTHA A K. Quantification of hydrogen peroxide and glucose using 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone hydrochloride with 10,11-dihydro-5H-benz (b,f)azepine as chromogenic probe[J]. Analytical Biochemistry, 2009, 395: 231-236.

    [12]JORDAAN J, LEUKES W D. Isolation of a thermostable laccase with DMAB and MBTH oxidative coupling activity from a mesophilic white rot fungus[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33: 212-219.

    [13]ANTHON G E, BARRETT D M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2- benzothiazohnonehydrazone[J]. Analytical Biochemistry, 2002, 305: 287-289.

    [14]JEFFRIES T W, YANG V W, DAVIS M W. Comparative study of xylanase kinetics using dinitrosalicylic, arsenomolybdate, and ion chromatographic assays[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1998, 70-72(1): 257-265.

    [15]BIELY P, PUCHART V. Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2006, 86 (11): 1636-1647.

    [16]HORN S J, EIJSINK V G H. A reliable reducing end assay for chitooligosaccharides[J]. Carbohydrate Polymers, 2004, 56: 35-39.

    [17]張永勤, 王哲平, 徐杰, 等. MBTH法測木糖含量的研究[J]. 食品科技, 2010, 35(4): 247-250.

    [18]GB/T 23874—2009飼料添加劑木聚糖酶活力的測定[S].

    [19]MILLER J N. Basic statistical methods for analytical chemistry Part 2. Calibration and regression rethods a review[J]. Analyst, 1991, 116: 3-14.

    [20]SCHOEL A, WELZEL M, KAUFMANN S H E. Quantification of protein in dilute and complex samples: modification of the bicinchoninic acid assay[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 1995, 30: 199-206.

    A Novel Method for Determining Trace Amounts of Xylanase Activity: MBTH

    ZHANG Yong-qin,WANG Fei,ZENG Fan-wei,WANG Zhe-ping,ZHANG Jie,ZHAO Xin,CHENG Qian (College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)

    A novel method for the quantitative determination of trace amounts of xylanase activity was established. The chromogenic conditions were explored according to the properties of xylan and its hydrolysates. The effects of several key hydrolysis parameters on the determination of xylanase activity were investigated by multiple-point procedures. The results showed that protein concentrations less than 30μg/mL did not interfere with the determination of xylanase activity. The optimal xylan concentration for the determination of xylanase activity was 4 mg/mL. High hydrolysis temperatures could inactivate xylanase. The most appropriate temperature for determining xylanase activity was 30 ℃, much lower than the optimal reaction temperature. The hydrolysis time was controlled within 60 min. The reaction time between hydrolysates and MBTH reagent was 13-16 min with the optimal level of 15 min. Based on 30 min hydrolysis, the detection limit and quantitation limit of the method were 0.135 mU/mL and 0.451 mU/mL, respectively. Properly prolonged hydrolysis time could improve the sensitivity of the method. The method was accurate, stable and even more sensitive than the DNS method.

    xylanase;MBTH;activity;xylan;xylose;determination

    Q814.9

    A

    1002-6630(2012)03-0044-04

    2011-02-19

    張永勤(1965—),女,教授,博士,主要從事酶工程、生化分析研究。E-mail:zyq0205@qust.edu.cn

    猜你喜歡
    木糖聚糖產(chǎn)物
    低共熔溶劑在天然產(chǎn)物提取中的應用
    一個空瓶
    相對分子質(zhì)量對木聚糖結(jié)晶能力的影響
    有心的小蘑菇
    布谷鳥讀信
    《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》青年編委會
    飼料用β-甘露聚糖酶活力的測定
    湖南飼料(2019年5期)2019-10-15 08:59:10
    產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選、鑒定及其酶學性質(zhì)研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:21
    低聚木糖在家禽中的應用
    廣東飼料(2016年8期)2016-02-27 11:10:01
    血清半乳甘露聚糖試驗對侵襲性肺曲霉菌感染的診斷價值
    成熟少妇高潮喷水视频| 看十八女毛片水多多多| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美日本视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 日韩av在线大香蕉| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲中文字幕日韩| 午夜精品一区二区三区免费看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 天天躁日日操中文字幕| 日韩欧美免费精品| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 少妇熟女aⅴ在线视频| 麻豆国产av国片精品| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久九九热精品免费| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日本色播在线视频| 午夜福利欧美成人| 亚洲电影在线观看av| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久久久久久黄片| 精品人妻1区二区| 亚洲真实伦在线观看| 最好的美女福利视频网| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久人人精品亚洲av| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲av熟女| 国产精品久久久久久精品电影| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 成人特级av手机在线观看| 两个人视频免费观看高清| 久99久视频精品免费| xxxwww97欧美| а√天堂www在线а√下载| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲七黄色美女视频| 国产亚洲91精品色在线| 在线观看一区二区三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品一区二区性色av| 在线国产一区二区在线| 欧美3d第一页| 日韩 亚洲 欧美在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜福利成人在线免费观看| 中亚洲国语对白在线视频| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 熟女电影av网| 婷婷亚洲欧美| 成人一区二区视频在线观看| bbb黄色大片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 能在线免费观看的黄片| 免费观看人在逋| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲电影在线观看av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美潮喷喷水| 亚洲avbb在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久9热在线精品视频| 日韩av在线大香蕉| 国产麻豆成人av免费视频| bbb黄色大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久久久久午夜电影| 国产高清激情床上av| 黄色女人牲交| 亚洲av免费在线观看| 九九热线精品视视频播放| 听说在线观看完整版免费高清| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久久午夜欧美精品| 51国产日韩欧美| 一进一出抽搐动态| 亚洲avbb在线观看| 窝窝影院91人妻| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 美女高潮的动态| 麻豆国产av国片精品| 美女cb高潮喷水在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产成人av教育| 欧美3d第一页| 午夜福利成人在线免费观看| 国产麻豆成人av免费视频| 日本一二三区视频观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一区二区三区四区激情视频 | 欧美人与善性xxx| 国产免费男女视频| 在线观看舔阴道视频| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品一区二区性色av| 中文字幕av成人在线电影| 1000部很黄的大片| 永久网站在线| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品1区2区在线观看.| 全区人妻精品视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 在线免费十八禁| 深爱激情五月婷婷| 日韩强制内射视频| 国内精品宾馆在线| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲第一电影网av| 一本一本综合久久| 男插女下体视频免费在线播放| 久久6这里有精品| 岛国在线免费视频观看| av视频在线观看入口| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费看美女性在线毛片视频| 精品午夜福利在线看| 热99在线观看视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲真实伦在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品一区二区性色av| 在线天堂最新版资源| 网址你懂的国产日韩在线| 欧美日本视频| 日韩欧美在线乱码| 波多野结衣巨乳人妻| 免费在线观看日本一区| 十八禁国产超污无遮挡网站| 日本在线视频免费播放| 国产在视频线在精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 老女人水多毛片| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美日韩黄片免| 最好的美女福利视频网| 成人三级黄色视频| 国产男靠女视频免费网站| 午夜福利高清视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 热99在线观看视频| 麻豆国产97在线/欧美| 色播亚洲综合网| 国产欧美日韩一区二区精品| 最后的刺客免费高清国语| bbb黄色大片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 赤兔流量卡办理| av福利片在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品,欧美在线| 免费av毛片视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久国产乱子免费精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 免费大片18禁| 日本欧美国产在线视频| 天堂影院成人在线观看| 国产午夜精品论理片| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产高潮美女av| 精品久久久久久,| 此物有八面人人有两片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 在线a可以看的网站| 国产精品人妻久久久久久| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品无大码| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲精品一区av在线观看| 免费看a级黄色片| 亚洲av.av天堂| 男女之事视频高清在线观看| 性色avwww在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品综合久久久久久久免费| 最好的美女福利视频网| 88av欧美| 国模一区二区三区四区视频| 午夜久久久久精精品| 亚洲专区国产一区二区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产探花极品一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品av视频在线免费观看| 波多野结衣高清作品| 国产一区二区在线av高清观看| 久久精品综合一区二区三区| 日本免费a在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 一夜夜www| 成人无遮挡网站| 精品欧美国产一区二区三| 三级毛片av免费| 特大巨黑吊av在线直播| 日本在线视频免费播放| 免费观看精品视频网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 麻豆国产97在线/欧美| 欧美一区二区亚洲| 一个人观看的视频www高清免费观看| 1024手机看黄色片| 午夜激情欧美在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲专区国产一区二区| 国产不卡一卡二| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品久久久久久久久av| 亚洲18禁久久av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 两个人的视频大全免费| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美色视频一区免费| 在线看三级毛片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 在线观看66精品国产| 男人舔女人下体高潮全视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲成a人片在线一区二区| 可以在线观看毛片的网站| 婷婷亚洲欧美| 国产午夜福利久久久久久| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 男女那种视频在线观看| 欧美区成人在线视频| 日韩精品有码人妻一区| 岛国在线免费视频观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 女人被狂操c到高潮| 久久久久久久久久久丰满 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产伦精品一区二区三区视频9| 我要搜黄色片| 精品日产1卡2卡| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 午夜a级毛片| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 别揉我奶头 嗯啊视频| 一级黄色大片毛片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲性夜色夜夜综合| 一本久久中文字幕| 精品日产1卡2卡| 黄色一级大片看看| 一区福利在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 精品一区二区三区人妻视频| 成人国产麻豆网| 国产精品免费一区二区三区在线| 色播亚洲综合网| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 黄色日韩在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 高清日韩中文字幕在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产真实乱freesex| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 不卡视频在线观看欧美| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲av.av天堂| 国产精品女同一区二区软件 | 一个人看视频在线观看www免费| 国产一区二区三区av在线 | 一本精品99久久精品77| 欧美潮喷喷水| 精品不卡国产一区二区三区| 国产三级在线视频| 亚洲av成人av| 亚洲精华国产精华精| 国产69精品久久久久777片| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲美女黄片视频| 久久精品影院6| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品伦人一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 一区二区三区激情视频| 一a级毛片在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久久免费精品人妻一区二区| 不卡一级毛片| 天堂动漫精品| 两人在一起打扑克的视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产黄a三级三级三级人| 成人鲁丝片一二三区免费| 少妇高潮的动态图| 国产私拍福利视频在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | ponron亚洲| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 毛片女人毛片| 成人精品一区二区免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成人无遮挡网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 五月伊人婷婷丁香| 俺也久久电影网| 国产精品野战在线观看| 亚洲美女视频黄频| 性欧美人与动物交配| 国产精品久久久久久久电影| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 精品久久久久久久久久久久久| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日韩精品青青久久久久久| 国产成人aa在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 成人性生交大片免费视频hd| 我的老师免费观看完整版| 午夜精品在线福利| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲最大成人手机在线| 国产一区二区三区视频了| 俺也久久电影网| 国产视频一区二区在线看| 日本 欧美在线| h日本视频在线播放| 一个人观看的视频www高清免费观看| 天天一区二区日本电影三级| 色播亚洲综合网| 99久久九九国产精品国产免费| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲性久久影院| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 色播亚洲综合网| 国产乱人伦免费视频| 国产精品久久久久久av不卡| 九九在线视频观看精品| 亚洲四区av| 999久久久精品免费观看国产| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲成人久久性| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人av一区二区三区在线看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 男人舔奶头视频| 很黄的视频免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产不卡一卡二| 内地一区二区视频在线| 国产精品一及| 亚洲在线观看片| 十八禁网站免费在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚州av有码| 精品久久久噜噜| 天堂√8在线中文| 级片在线观看| 国产不卡一卡二| 韩国av在线不卡| 亚洲色图av天堂| 在线天堂最新版资源| 动漫黄色视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 日日夜夜操网爽| eeuss影院久久| 热99re8久久精品国产| 国产爱豆传媒在线观看| 一区二区三区免费毛片| 高清在线国产一区| 波多野结衣高清无吗| 麻豆国产av国片精品| 亚洲成人免费电影在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 日本三级黄在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 最近最新免费中文字幕在线| 日日夜夜操网爽| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲成人久久爱视频| 精品一区二区三区人妻视频| 久久亚洲真实| 亚洲午夜理论影院| 十八禁网站免费在线| 国产成人a区在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲男人的天堂狠狠| 麻豆久久精品国产亚洲av| 天天躁日日操中文字幕| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 色在线成人网| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久久久久久久久人人人人人人| 卡戴珊不雅视频在线播放| 中文字幕久久专区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品一二三区在线看| 身体一侧抽搐| av女优亚洲男人天堂| 我的老师免费观看完整版| 亚洲,一卡二卡三卡| 91狼人影院| 国产亚洲91精品色在线| 人妻系列 视频| av在线观看视频网站免费| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品一区二区在线观看99| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 黄色视频在线播放观看不卡| av天堂中文字幕网| 91精品国产国语对白视频| 久久久精品免费免费高清| 99热网站在线观看| www.色视频.com| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品成人在线| 在线免费十八禁| 国产精品一区二区性色av| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲欧美日韩东京热| 18禁在线播放成人免费| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 少妇人妻 视频| av线在线观看网站| 久久99热这里只有精品18| 日本黄色片子视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久午夜福利片| 看免费成人av毛片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 最后的刺客免费高清国语| 高清视频免费观看一区二区| 深爱激情五月婷婷| 亚洲国产日韩一区二区| 最新中文字幕久久久久| 香蕉精品网在线| 久久热精品热| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 人妻一区二区av| 黄色怎么调成土黄色| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品一区二区在线观看99| 国产亚洲最大av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品一区二区在线观看99| 女性被躁到高潮视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 日韩一区二区视频免费看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产精品久久久久久精品古装| 18+在线观看网站| 国产精品一及| a 毛片基地| 看免费成人av毛片| 97超视频在线观看视频| 最近的中文字幕免费完整| 大陆偷拍与自拍| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久久久久久久久成人| 国产一区二区在线观看日韩| 99久久综合免费| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产极品天堂在线| 一区二区三区免费毛片| 国产伦在线观看视频一区| 日韩av免费高清视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产成人免费观看mmmm| 国产乱人偷精品视频| 久久精品国产自在天天线| 午夜激情福利司机影院| 亚洲经典国产精华液单| 午夜免费鲁丝| 在线观看一区二区三区激情| 成人国产麻豆网| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 人妻少妇偷人精品九色| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 在线观看免费高清a一片| 国产成人一区二区在线| 成人特级av手机在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久视频综合| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品无大码| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 精品午夜福利在线看| 国产精品人妻久久久久久| 久久 成人 亚洲| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品伦人一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产av一区二区精品久久 | 联通29元200g的流量卡| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 熟女人妻精品中文字幕| 成年女人在线观看亚洲视频| 十分钟在线观看高清视频www | 久久久久久久久久成人| 春色校园在线视频观看| 中文欧美无线码| 乱码一卡2卡4卡精品| 丰满乱子伦码专区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩av不卡免费在线播放| 中文字幕亚洲精品专区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 联通29元200g的流量卡| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 身体一侧抽搐| 美女视频免费永久观看网站| 黑人高潮一二区| 成人午夜精彩视频在线观看| av国产精品久久久久影院| 天堂中文最新版在线下载| 久久99热6这里只有精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 另类亚洲欧美激情| 亚洲成人手机| 男女边摸边吃奶| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲国产欧美人成| 亚洲色图av天堂| 最近的中文字幕免费完整| www.色视频.com| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久精品94久久精品| 成人免费观看视频高清| 乱系列少妇在线播放| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产免费又黄又爽又色| 天美传媒精品一区二区| 国产免费福利视频在线观看| 免费看日本二区| 亚洲内射少妇av| 久久女婷五月综合色啪小说| 97精品久久久久久久久久精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产av一区二区精品久久 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 日本与韩国留学比较| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久影院123| 国产有黄有色有爽视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 黑人高潮一二区| 岛国毛片在线播放| 欧美精品亚洲一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 中文在线观看免费www的网站| 午夜免费鲁丝| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 九九爱精品视频在线观看| 久久久精品94久久精品| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 久久精品久久久久久久性| 日韩中文字幕视频在线看片 | 久久国内精品自在自线图片| 国产黄频视频在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 一级a做视频免费观看| 岛国毛片在线播放| 韩国av在线不卡| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久久久久久成人| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 草草在线视频免费看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产老妇伦熟女老妇高清| 视频区图区小说|