CRISPR系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展

蔣 偉，黎滿香，田世成，顏運(yùn)秋

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)菌往往通過(guò)各種各樣的策略來(lái)使自己適應(yīng)各種環(huán)境，從而使細(xì)菌能在各種復(fù)雜的環(huán)境中生存。而在基因水平，細(xì)菌能獲得新的外源基因促使它抵抗環(huán)境選擇壓力，這是細(xì)菌進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)重要因素。很多細(xì)菌和古細(xì)菌都是從其他細(xì)菌中利用核酸交換來(lái)獲得外源基因，這種交換被稱為基因水平轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer；HGT），例如糞腸球菌中約三分之一的基因組由可移動(dòng)性片段組成。HGT即是從環(huán)境中攝取可移動(dòng)性片段的DNA（例如質(zhì)粒，噬菌體等），然后整合到自己的基因組中從而獲得相應(yīng)的表型的過(guò)程。然而在這些水平轉(zhuǎn)移中，只有極少一部分能給細(xì)菌提供選擇優(yōu)勢(shì)。為避免冗于的水平轉(zhuǎn)移（即不能給宿主細(xì)菌提供選擇優(yōu)勢(shì)的水平轉(zhuǎn)移），細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中形成了上百種的自我保護(hù)機(jī)制，例如目前了解最為透切的消除入侵生物的限制性修飾酶系統(tǒng)和表面排斥現(xiàn)象等［1］。

近期研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR位點(diǎn) （CRISPR loci）廣泛存于細(xì)菌及古細(xì)菌基因組中。其主要結(jié)構(gòu)以高度保守的重復(fù)序列、完全不同的間區(qū)相互交替排列而成，在這種重復(fù)序列遠(yuǎn)端還存在與這種重復(fù)序相關(guān)的蛋白，二者相互輔助以完成其特定的生物學(xué)功能。

1 CRISPR位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)

Ishino Y等［2］在對(duì)大腸埃希菌中的堿性磷酸酶的同工酶Ipa對(duì)應(yīng)的核酸序列進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)在該產(chǎn)物編碼區(qū)的下游存在一個(gè)由29個(gè)堿基組成的、重復(fù)出現(xiàn)的高度保守的核酸序列，兩個(gè)重復(fù)序列之間由長(zhǎng)度大致相等的獨(dú)特的非重復(fù)核酸序列間隔開(kāi)。隨后，Mojica F J等［3］在對(duì)地中海極嗜鹽菌（Haloferaxmediterranei）和沃爾卡尼極嗜鹽菌（Haloferax volcanii）的研究中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)構(gòu)。在其他一些細(xì)菌的研究中，這種類似的基因結(jié)構(gòu)被廣泛報(bào)道。隨著類似的結(jié)構(gòu)被廣泛的發(fā)現(xiàn)，直到1991年Hermans P W等才把這種結(jié)構(gòu)正式命名SRSR（short regularly spaced repeats），2002年被Jansen R改名為CRISPR并一直沿用至今［3－7］。隨著細(xì)菌的全基因組測(cè)定的完成，已經(jīng)在90%的古細(xì)菌及40%的細(xì)菌基因組中發(fā)現(xiàn)CRISPR位點(diǎn)，更令人驚奇的是在大部分已發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的細(xì)菌中含有至少1個(gè)CRISPR位點(diǎn)，有的甚至含有2個(gè)或3個(gè)該位點(diǎn)［8］。

2 CRISPR－Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

2.1 CRISPR位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)

CRISPR位點(diǎn)由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)（leader）、多個(gè)重復(fù)序列（repeat）和多個(gè)間區(qū)（spacer）組成，這些重復(fù)序列與間區(qū)相互交替出現(xiàn)并串連成一個(gè)完整的CRISPR位點(diǎn)（如圖1A）。前導(dǎo)區(qū)一般是處于CRISPR位點(diǎn)上游，由300bp～500bp堿基組成的一個(gè)AT富集的區(qū)域。這個(gè)區(qū)域一般來(lái)說(shuō)在種內(nèi)是比較保守的，但在種間卻有顯著的差異［7］。重復(fù)序列一般由23bp～50 bp的堿基組成，其平均長(zhǎng)度在31bp左右。這段序列在已給定的CRISPR位點(diǎn)的多個(gè)重復(fù)中相對(duì)保守，一般只存在1個(gè)～3個(gè)堿基差異，這種差異被稱為退化重復(fù)（degeneration repeats，DRs），但在微生種間甚至于同一個(gè)基因組中的兩個(gè)或多個(gè)不同的CRISPR位點(diǎn)間卻存在很大的差異。通過(guò)對(duì)CRISPR DataBase［8］中貯存的所有重復(fù)序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列間沒(méi)有明顯的聯(lián)系，但卻具有二重對(duì)稱性，這就意味著它能形成像發(fā)夾一樣的二極結(jié)構(gòu)。到目前為止，還沒(méi)有關(guān)于這些重復(fù)序列具體功能的描述。間區(qū)由17bp～84bp堿基組成，平均長(zhǎng)度在36bp左右。在同一個(gè)CRISPR位點(diǎn)中，基本上沒(méi)有相同或比較相似的間區(qū)。通過(guò)長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn)，部分間區(qū)序列與已知的或質(zhì)粒、或噬菌體的序列相匹配［3］。在CRISPR DataBase中的間區(qū)序列，只有約2%的序列在Gen－Bank中能找到相應(yīng)的匹配，這可能是因?yàn)槟壳爸挥袠O少的噬菌體和質(zhì)粒被測(cè)序分析，隨著測(cè)序分析技術(shù)的逐漸成熟，這個(gè)比例在不斷的增加［9］。

圖1 CRISPR位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖（A代表CRISPR位點(diǎn)；B代表整個(gè)CRISPR系統(tǒng)）Fig.1 The structure of CRISPR－loci（A represents CRISPR loci；B represents the whole element of CRISPR system）

2.2 CRISPR－Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

在生物機(jī)體內(nèi)，最終起到調(diào)節(jié)生命作用的物質(zhì)是肽或者蛋白質(zhì)，而如圖1A所示的整個(gè)區(qū)域都是非編碼區(qū)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)CRISPR位點(diǎn)的功能顯然不現(xiàn)實(shí)。因此，在微生長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，為了使CRISPR宿主能適應(yīng)各種環(huán)境，必定有相關(guān)蛋白質(zhì)起著調(diào)節(jié)作用。Jansen R等［7］對(duì)CRISPR側(cè)翼序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)4段基因，并依次命名為cas1、cas2、cas3、cas4，這4段基因通常都與CRISPR位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)于幾乎所有CRISPR位點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)菌的基因組中，且這4段基因在不同的細(xì)菌基因組間具有顯著的同源性，說(shuō)明這4段基因可能與CRISPR位點(diǎn)存在某種關(guān)系。這些Cas蛋白或鄰接于CRISPR位點(diǎn)下游（圖1B），或分散于其他地方，目前發(fā)現(xiàn)距CRISPR位點(diǎn)最遠(yuǎn)的達(dá)到了9 kb。通過(guò)進(jìn)一步分析這些蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)存在高度保守的氨基酸殘基或／和功能結(jié)構(gòu)域（amino acid resi－dues or／and functional domains）。這4個(gè)蛋白通常以cas4－cas3－cas1－cas2的順序存在于染色體或質(zhì)粒上，其中Cas3類似于一種解旋酶，而Cas4類似于RecB家簇的一種半胱氨酸富集的核酸內(nèi)切酶上。這些酶的功能以及其排列順序或許預(yù)示著這些蛋白質(zhì)存在一種特定的作用機(jī)制。通過(guò)大量的序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，Cas1似乎是CRISPR位點(diǎn)中最基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)，因?yàn)樵谒泻蠧RISPR位點(diǎn)的生物種中都發(fā)現(xiàn)了cas1。到目前為止，已有40多種伴隨CRISPR位點(diǎn)的Cas蛋白被鑒定［10］。這些蛋白存在多樣性，有趣的是每一個(gè)CRISPR都含有一個(gè)特異性的CRISPR位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的被縮寫為csx（“x”代表亞型的第一個(gè)字母，例如，csy代表Yersina亞型）的基因，因此Haft D H等跟據(jù)該位點(diǎn)對(duì)45種Cas蛋白的攜帶情況，將CRISPR位點(diǎn)分成9種亞型（表1）［15］。由表1可以看出cas1－cas6這六種蛋白廣泛存在于CRISPR亞型中，可以說(shuō)是CRISPR位點(diǎn)的核心蛋白，而其中又?jǐn)?shù)cas1最為常見(jiàn)，存在于所有亞型中［11］。但對(duì)于普遍存在于所有亞型中的Cas1蛋白的功能卻存在較大的爭(zhēng)論。Wiedenheft B等從綠膿桿菌中得到的Cas1蛋白有金屬依賴性，dsDNA特異性核酸內(nèi)切酶功能，而Han D H等從Sulpholobus solfataricus中得到的Cas1蛋白卻表現(xiàn)為序列非特異性、多位點(diǎn)、高親合力的核酸結(jié)合蛋白的功能［12－14］。

3 CRISPR位點(diǎn)的功能

在自然界中，微生物可以說(shuō)無(wú)處不在。當(dāng)細(xì)菌存在于較為惡劣的環(huán)境中時(shí)，它該如何抵御外界的干擾呢？從地球上開(kāi)始有生物至今，在長(zhǎng)期的自然選擇壓力作用下，這些微生物得以進(jìn)化，使其能在自然選擇的壓力下存活。在這個(gè)漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，它們形成了許多用于保護(hù)自己的，幾乎接近完美的功能性系統(tǒng)。這些功能性系統(tǒng)能使其從其他微生物或環(huán)境中獲得對(duì)自己有利的基因，例如基因盒－整合子系統(tǒng)（integron－cassette system）能使細(xì)菌從其他供體菌中獲得用來(lái)抵抗環(huán)境中對(duì)應(yīng)藥物的耐藥基因；但同時(shí)也存在另外一些系統(tǒng)限制這種過(guò)程的發(fā)生，一般來(lái)說(shuō)是限制對(duì)自己有害的基因進(jìn)入自身，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的，例如許多革蘭陽(yáng)性及革蘭陰性菌中的表面排拆（surface exclusion）功能，它能從分子水平降低受體菌的接受能力，從而降低自身對(duì)有害的基因片段的接受能力［16］。

表1 Cas蛋白亞型的分類Table 1 Classification of Cas protein subtypes

在這些自我保護(hù)系統(tǒng)中，CRISPR系統(tǒng)亦是其中之一。最早人們對(duì)CRISPR系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)是通過(guò)對(duì)噬菌體的研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體是細(xì)菌最為常見(jiàn)的入侵者（invader），為了抵御噬菌體的入侵，即在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中細(xì)菌形成了用于抵抗噬菌體入侵的CRISPR系統(tǒng)，從分子水平來(lái)說(shuō)，這個(gè)過(guò)程可分為三個(gè)階段。（1）合并整合形成新間區(qū)；（2）表達(dá)加工 CRISPR RNAs（crRNAs）；（3）crRNAs干擾入侵的噬菌體［17］。整個(gè)過(guò)程類似于機(jī)體的免疫反應(yīng)過(guò)程，故而此過(guò)程被稱為遺傳記憶（genetic memory）。

3.1 新間區(qū)的獲得

當(dāng)細(xì)菌與噬菌體共處于同一環(huán)境中時(shí)，噬菌體為了自身生存，必定定植于細(xì)菌表面，然后借助于細(xì)菌DNA復(fù)制的機(jī)制進(jìn)行繁殖。當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入攜帶有CRISPR系統(tǒng)的細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)，該宿主體內(nèi)的CRISPR相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合體中類似于Cas1核酸結(jié)合蛋白將會(huì)迅速的介導(dǎo)該復(fù)合體與噬菌體DNA進(jìn)行結(jié)合，然后通過(guò)類似于Cas2核酸內(nèi)切酶功能等蛋白質(zhì)的作用，將該DNA切割成17bp～84bp不等的核酸小片段，然后在相關(guān)蛋白的作用下，將其中的一個(gè)小片段整合至前導(dǎo)區(qū)與第一個(gè)重復(fù)之間形成一個(gè)新的間區(qū)（圖2A）。通過(guò)這樣一個(gè)過(guò)程，CRISPR位點(diǎn)就整合進(jìn)了一個(gè)新的間區(qū)。這就使宿主快速的適應(yīng)環(huán)境中的入侵者，因此我們也可以將這個(gè)階段稱為適應(yīng)（Adaptation）階 段。Bolotin A 等［18］研 究 發(fā) 現(xiàn)，CRISPR位點(diǎn)中間區(qū)的個(gè)數(shù)與宿主對(duì)噬菌體的敏感性呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)而Barrangou R等利用噬菌體去攻擊至少含有一個(gè)CRISPR位點(diǎn)的嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus），最終在前導(dǎo)序列及第一個(gè)重復(fù)間區(qū)找到一個(gè)新的間區(qū)，而且變異株對(duì)該噬菌體的敏感性降低，證明了該位點(diǎn)具有抵御外源DNA片段的入侵的功能［19－20］。在序列分析中，有些序列來(lái)源于細(xì)菌質(zhì)粒，證明CRISPR位點(diǎn)也能從質(zhì)粒上獲得新的間區(qū)。

3.2 表達(dá)加工處理CRISPR

當(dāng)新的間區(qū)穩(wěn)定地存在于CRISPR位點(diǎn)后，間區(qū)所包含的信息將通過(guò)CRISPR途徑來(lái)保護(hù)宿主不受特定的核酸攻擊。然而要實(shí)現(xiàn)這樣一個(gè)途徑，最基本的就是要將間區(qū)加工處理以形成較小的crRNAs。CRISPR的轉(zhuǎn)錄首先在閃爍古球菌（Archaeoglobusfulgidus）中被發(fā)現(xiàn)［21］。此研究表明位點(diǎn)中的轉(zhuǎn)錄首先從前導(dǎo)序列的末端開(kāi)始，也就是說(shuō)在前導(dǎo)序列的末端可能含有CRISPR啟動(dòng)子（CRISPR promoter），從啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，重復(fù)序列和間區(qū)先被轉(zhuǎn)錄成前體物RNA（precursor RNA；pre－crRNA）。此時(shí)核心蛋白Cas1－Cas4將會(huì)共同形成一個(gè)復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物將pre－crRNA從特異性位點(diǎn)上（此特異性位點(diǎn)具體何在尚不清楚，有報(bào)道表明在間區(qū)的約第8個(gè)堿基處，但也有報(bào)道稱在重復(fù)序列上）剪切成更小的crRNA，隨后較小的crRNA與蛋白質(zhì)形成具有特殊功能的復(fù)合物crRNP（crRNA－Cas ribonucleoprotein）［22］（圖2B）。

3.3 crRNAs干擾入侵核酸

當(dāng)宿主再次接觸到環(huán)境中的噬菌體或是質(zhì)粒時(shí)，crRNP將會(huì)迅速地通過(guò)核酸結(jié)合蛋白與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的外源核酸特異性結(jié)合，這種特異性是由新整合進(jìn)入間區(qū)所存貯的信息決所決定。然后在核酸內(nèi)切酶的作用下，將目標(biāo)核酸從3′端開(kāi)始剪切成適合長(zhǎng)度（大約為18bp）的小片段，致使目標(biāo)核酸無(wú)法形使它的功能，噬菌體復(fù)制失敗，質(zhì)粒轉(zhuǎn)移失敗，從而達(dá)到保護(hù)宿主的目的（圖2C）。

通過(guò)以上三個(gè)階段，CRISPR位點(diǎn)行使了它具有的功能。然而它仍然面臨所有生理反應(yīng)所面臨的問(wèn)題，即如何識(shí)別自身與非自身核酸，從而避免發(fā)生“自身免疫”。在CRISPR位點(diǎn)中，新間區(qū)所攜帶的與crRNA仍然存在著對(duì)應(yīng)的關(guān)系。最近一項(xiàng)研究表明，crRNP在體外試驗(yàn)中，能夠區(qū)別目標(biāo)核酸與非目標(biāo)核酸［23］，可能是因crRNP中的crRNA與目標(biāo)核酸存在對(duì)應(yīng)的配對(duì)關(guān)系，從而能準(zhǔn)確的識(shí)別目標(biāo)核酸。

4 展望

到目前為止，CRISPR位點(diǎn)在很多細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)。這樣普遍的存在于細(xì)菌及古細(xì)菌中，證明該位點(diǎn)對(duì)于細(xì)菌的生存進(jìn)化有著舉足輕重的作用。通過(guò)進(jìn)一步深入的研究，探明該位點(diǎn)的作用機(jī)制，將使我們對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)更加深入。一方面，通過(guò)該位點(diǎn)的間區(qū)序列差異，理論上可以推論該細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程的某些細(xì)節(jié)。另一方面，通過(guò)目前對(duì)于該位點(diǎn)的研究，如果能將該位點(diǎn)通過(guò)分子生物學(xué)方法，整合進(jìn)入工程質(zhì)粒，然后應(yīng)用于工業(yè)細(xì)菌中，例如食物產(chǎn)品及大規(guī)模發(fā)酵等領(lǐng)域，將會(huì)給食品安全帶來(lái)一個(gè)革命性的轉(zhuǎn)折。另外，利用該位點(diǎn)的干擾功能，我們亦可在其中引入某種內(nèi)源性基因的間區(qū)，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主，或許可以達(dá)到基因沉默的目的，但這一點(diǎn)尚沒(méi)有試驗(yàn)證明。此外，CRISPR位點(diǎn)既然能抵御外源基因的入侵，那么由可移動(dòng)元件介導(dǎo)的耐藥基因在細(xì)菌的的傳播過(guò)程是否也能被這種機(jī)制所抑制呢？關(guān)于這一點(diǎn)尚待試驗(yàn)證明［24］。如果該位點(diǎn)對(duì)于某些耐藥性質(zhì)粒或是耐藥基因，也能達(dá)到沉默的目的，那么，通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)的克隆、轉(zhuǎn)化，將會(huì)使全球性的耐藥問(wèn)題得以緩解。

總之，介于該位點(diǎn)中已知的作用機(jī)制和有待試驗(yàn)證明的未知的作用機(jī)制，該位點(diǎn)對(duì)于我們對(duì)微生界的認(rèn)識(shí)都有十分顯著的作用。因此，對(duì)于CRISPR位點(diǎn)的研究，具有無(wú)可比擬的重要性。

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