妊娠山羊腺垂體中ER與PRL、FSH和LH 的共存性研究

熊東升，呂顏枝，2，代盈盈，王文麗，趙慧英＊

（1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌712100；2.徐州生物工程職業(yè)技術學院，江蘇徐州221006）

雌激素是下丘腦－垂體－性腺軸中影響動物生殖活動的重要激素之一，其主要通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）調節(jié)靶細胞，ER 包括 ERα和ERβ兩種經典亞型。腺垂體通過分泌多種激素如催乳素（prolactin，PRL）和促性腺激素（包括促卵泡素（follicle－stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）等調節(jié)機體生殖相關內分泌活動，雌激素對這些激素的分泌具有反饋調節(jié)作用。有研究表明［1－2］，妊娠大鼠腺垂體中有大量ER陽性細胞，其表達量隨著妊娠進行而增加；RTPCR定量分析發(fā)現(xiàn)，在妊娠中期ERαm RNA表達有一個顯著的高峰，但ERα蛋白水平表達恒定，ERβ在妊娠期的表達沒有發(fā)生變化，與雌激素的水平不相關。雌激素可通過ER的介導來調節(jié)下丘腦促性腺激素釋放激素（Gn RH）的刺激作用，進而調節(jié)FSH和LH的分泌；另外，雌激素還促進PRL的合成、儲存和釋放，為產后泌乳做好準備［3－4］。朱雨嵐等［5］用雙標記的方法對人類多激素型垂體腺瘤的研究中證明了ER在垂體的PRL、FSH和LH分泌細胞中表達。但目前對于妊娠期山羊腺垂體中ERα和ERβ與激素分泌細胞的共存研究尚未見報道。本試驗用免疫組化雙標記法對腺垂體中ERα和ERβ與PRL、FSH和LH的共表達進行研究，為闡明妊娠期山羊的生殖內分泌調節(jié)提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 妊娠前期（1 d～30 d）、中期（31 d～120 d）、后期（121 d～150 d）山羊各5只，購自楊凌農戶。

1.1.2 主要試劑和儀器 抗兔免疫組織化學Max－Vision超敏試劑盒、兔抗羊PRL多克隆抗體、棕色DAB染色試劑盒，購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；兔抗羊（ERα、ERβ、FSH、LH）多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術開發(fā)有限公司；藍色DAB顯色劑、葡萄糖過氧化物酶，購自美國SIGMA公司；德國Leica石蠟切片機；Motic顯微照相機；江蘇捷達科技形態(tài)學分析軟件。

1.2 方法

1.2.1 取材及材料處理 山羊經放血致死后迅速取下羊頭，先用37℃的生理鹽水向兩側頸總動脈同時注入400 mL～500 mL沖去殘血，隨后灌注等量4℃的40 g／L多聚甲醛固定液。開顱取出垂體后固定24 h。固定后自來水沖洗24 h，再酒精脫水，二甲苯透明后浸蠟包埋，最后做石蠟連續(xù)切片（6μm）。

1.2.2 免疫組織化雙標記法染色法程序 切片經脫蠟復水和抗原修復后做雙標染色：①滴加30 mL／L過氧化氫，室溫10 min；②滴加ERα和ERβ多克隆抗體之一（1∶200）室溫下孵育60 min；③滴加Max Vision試劑室溫下孵育10 min～15 min；棕色DAB呈色；④25 g／L高錳酸鉀－50 mL／L硫酸洗脫液洗脫5 min，滅活ER剩余抗體活性，再用5 g／L焦亞硫酸鈉還原30 s。⑤滴加第二種一抗PRL、FSH 和LH 之一（1∶200）室溫下孵育60 min；⑥滴加Max Vision試劑室溫下孵育10 min～15 min；藍色DAB呈色，以上各步之間均用0.01 mol／L PBS緩沖液沖洗。最后常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照試驗用0.01 mol／L PBS代替兩種一抗，其他步驟相同。最后觀察結果，顯微照相及用江蘇捷達科技形態(tài)學分析軟件分析。

2 結果

2.1 免疫組化雙標染色的結果

經免疫組織化學雙標記法染色的切片，ERα或ERβ免疫陽性產物為棕褐色；PRL、FSH和LH免疫陽性產物為藍色；雙標記則為棕黑色。

2.1.1 妊娠各期ERα與3種激素的共存 在妊娠前期ERα與PRL共同著色的細胞數(shù)量較少，多呈橢圓形，ERα多存在于PRL細胞的胞質中，胞核中少見著雙色，背景呈淺藍色（圖1A1）；妊娠中后期著藍色較深的PRL陽性細胞較多，著棕色的ERα陽性細胞散在于PRL陽性細胞之間，僅少量的雙著色細胞膜（圖1A2、圖1A3）。妊娠前期ERα與FSH共同著色的細胞數(shù)量較多，多數(shù)存在于血竇周圍呈橢圓形或多邊形，胞質重合著色較深，其他區(qū)域細胞可見胞膜著雙色，背景呈淺棕色，妊娠前期和中期ERα和FSH共存于腺垂體細胞的胞質和胞膜中（圖1B1、圖1B2）；后期多在胞質中共存（圖1B3）；妊娠前期和中期ERα與LH共同著色位置在細胞的胞質中（圖1 C1、圖1C2）；妊娠后期可見胞膜著雙色，還可見著棕色的ERα顆粒（圖1C3）。

圖1 山羊妊娠各期ERα和與PRL、FSH和LH在垂體中的免疫組化雙標染色（400×）Fig.1 The immunohistochemical double labeled stain of ERαwith PRL，F(xiàn)SH，LH in pituitary of different gestation periods in goats（400×）

2.1.2 妊娠各期ERβ與3種激素的共存 ERβ和PRL的共存的細胞個體較小呈胞質深著色，夾雜在淺藍色的PRL陽性細胞之間，數(shù)量在整個妊娠過程中有逐漸增多的現(xiàn)象，ERβ多數(shù)存在于PRL細胞的胞質中，少數(shù)存在于胞核中（圖2A1、A2、A3）。妊娠過程中ERβ與FSH的共同著色細胞多為腺垂體遠側部的嗜堿粒細胞，形狀與ERα和FSH共存的細胞相似，陽性物質多存在于胞質和胞核，未見有胞膜著色的，數(shù)量也呈減少趨勢（圖2B1、B2、B3）。在妊娠后期有個別全細胞著色（圖2 B3）。妊娠前期和中期ERβ與LH的共同著色細胞為腺垂體遠側部的嗜堿粒細胞，陽性物質呈多邊形（圖2C1、C2），數(shù)量隨妊娠的進行逐漸增多。在妊娠后期陽性細胞在胞質和核膜均有ERβ和LH的共存，未見核著色（圖2C3）。

圖2 山羊妊娠各期ERβ與PRL、FSH和LH在垂體中的免疫組化雙標染色（400×）Fig.2 The immunohistochemical double labeled stain of ERβwith PRL，F(xiàn)SH，LH in pituitary of different gestation periods in goats（400×）

2.2 妊娠各期ER與腺垂體中3種激素共存細胞的數(shù)量

免疫組化雙標染色結果顯示，ERα和ERβ分別與PRL、FSH和LH共存的陽性細胞數(shù)量有一定變化趨勢，表現(xiàn)為ERα和ERβ分別與PRL和LH共存的陽性細胞的數(shù)量隨妊娠進行逐漸增加；與FSH共存的陽性細胞數(shù)量則逐漸減少（表1）。

表1 妊娠期腺垂體中陽性細胞的數(shù)量Table1 The number of positive cells in adenohypophysis during pregnancy

3 討 論

Gonza M等［6］研究大鼠垂體中ER兩種亞型的分布，發(fā)現(xiàn)在大鼠整個發(fā)情期，ERα陽性產物均多數(shù)分布于PRL細胞，少數(shù)分布于FSH細胞，ERβ陽性產物僅有少數(shù)分布于PRL和FSH細胞；ERα的陽性產物存在于胞質及胞核，且與發(fā)情周期有關，ERβ的陽性產物多存在于胞質。本試驗免疫組織化學染色顯示，妊娠期山羊腺垂體ERα和ERβ均與PRL、FSH和LH有共存，主要共存于胞質中，也有少數(shù)在胞膜或胞核中共存，并隨著妊娠的進行在細胞中分布位置發(fā)生變化。說明不同的動物不同的生理時期ERα和ERβ在細胞中的分布位置和存在細胞的類型也不一樣。對綿羊垂體中ER的研究表明［7］，妊娠145 d后綿羊垂體中ERα蛋白的表達較之前有很大的升高，但ERβ蛋白的表達與妊娠后80 d和120 d相比則是減少。研究表明［8］，ER在分泌PRL和PRL細胞增生方面起重要作用，ER基因敲除小鼠PRL mRNA表達明顯減少，PRL細胞數(shù)減少，而LH和FSH 細胞表達增加［9］。本試驗結果表明ER與PRL和LH共存陽性細胞的數(shù)量表現(xiàn)為隨妊娠的進行逐漸增加，與FSH的共存則相反，與該研究結構一致。胞漿內的ER具有運載雌激素的作用，胞核內的ER具有轉錄因子的作用［10－11］，兩種ER亞型均可以介導雌激素的作用［12－13］，表明在妊娠期雌激素可能通過ERα和ERβ來作用于PRL、FSH和LH的分泌，但是以ERα對PRL和FSH的分泌調控為主，推測其主要目的是為產后泌乳做準備。

［1］楊永倩.ER和ICAM－1在妊娠早期和流產大鼠下丘腦、垂體、卵巢和子宮中的表達［D］.陜西楊凌：西北農林科技大學，2008.

［2］Vaillant C，Chesnel F，Schausi D，et al.Expression of estrogen receptor subtypes in rat pituitary gland during pregnancy and lactation［J］.Endocrinology，2002，143（11）：4249－4258.

［3］Nett T M，Turzillo M，Baratta M，et al.Pituitary effects of steroid hormones on secretion of follicle－stimulating hormone and luteinizing hormone［J］.Domest Anim Endocrinol，2002，23（12）：33－42.

［4］Clarke I J，Cummins J T.Direct pituitary efects of estrogen and progesterone on gonadotropin secretion in the ovariectomized ewe［J］.Neuroendocrinology，1984，39：267－274.

［5］朱雨嵐，劉 偉，俞春江，等.雌激素受體在人類多激素型垂體腺瘤中的表達［J］.哈爾濱醫(yī)科大學學報，2004，38（5）：429－434.

［6］González M，Reyes R，Damas C，et al.Oestrogen receptorα andβin female rat pituitary cells：An immunochemical study［J］.Gene Compara Endocrinol，2008，155：857－868.

［7］Price R H，Butler C A，Webb P，et a1.A splice variant of estrogen receptor beta missing exon displays altered subnuclear localization and capacity fortranscriptional activation ［J］.Endocrinology，2006，142（5）：2039－2049.

［8］Schaub C E，Gersting J A ，Maureen K W ，et al.Development of ER－αand ER－βexpression in the developing ovine brain and pituitary［J］.Gene Expression Patterns，2008，8：457－463.

［9］Stefaneanu L.Pituitary sex steroid receptors：localization and function［J］.Endocrine Pathology，1997，8：91－108.

［10］蔡 晶，曹治云，杜 建.雌激素受體的基因結構、組織分布及表達量的研究進展［J］.中國老年學雜志，2007，27（24）：2468－2470.

［11］Bulayeva N N，Wozniak A L，Lash L L，et al.Mechanisms of membrane estrogen receptor－alpha mediated rapid stimulation of Ca2＋levels and prolactin release in apituitary cell line［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2005 ，288（2）：388－397.

［12］Jensen E V，DeSombre E R，Estrogen－receptor interaction［J］.Science，1973，182：126－134.

［13］Kuiper G G，Enmark E，Pelto－Huikko M，et al.Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary［C］.Proceedi Nation Aca Sci USA，1996，93：5925－5930.